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白细胞介素-7基因治疗卵巢癌的体外研究

程蓓  
【摘要】: 卵巢癌是人类最难治愈的癌肿之一,尽管许多年来手术、化疗和放疗均已取得了 长足的进展,但术后复发和化疗耐药仍然难以突破,晚期卵巢癌的五年生存率始终得 不到改善。近些年来,随着细胞工程和基因工程技术的发展,肿瘤免疫治疗亦得以迅 猛发展,细胞因子基因治疗(cytokine gene tnerapy)是目前研究的热点。因为卵巢癌 难治、易复发,从而成为细胞因子基因治疗的合适模型。白细胞介素7 (Interleukin-7,IL-7)是一种较新的细胞因子,起初只认识到它是B细胞生长因子, 后来研究发现,IL-7具有与IL-2相似的活性,除了可促进B前体细胞增殖分化外, IL-7也是一种T细胞生长因子,促进CD_4~+、CD_8~+T细胞成熟,刺激静息T细胞增 殖,并可诱导出一定水平的LAK及CTL活性,IL-7具有的生物学活性意味着它在抗 肿瘤方面有着潜在的意义。目前人们对IL-7抗肿瘤作用的研究热点是过继免疫治疗 和基因治疗,最近的实验和临床研究表明,将IL-7cDNA导入黑色素瘤细胞、结肠癌 细胞、肾细胞癌细胞、纤维肉瘤细胞等,发现转染后肿瘤细胞IL-7高表达,癌细胞 免疫原性增加,体内成瘤性下降,淋巴细胞对其杀伤活性明显提高。迄今国内外尚未 见IL-7基因治疗卵巢癌的相关报道。本研究将IL-7cDNA基因转染卵巢上皮癌细胞株 SKOV3,观察IL-7基因转染前后肿瘤细胞形态、增殖活性、免疫原性、细胞因子分 泌以及对LAK细胞的杀伤敏感性的变化,旨在探讨IL-7用于卵巢癌细胞因子基因治 疗的潜在价值。 第一部分 人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建 目的:运用分子克隆技术获得人IL-7cDNA并且构建得到人IL-7真核、原核双相 表达载体PBK-CMV-IL-7,为下一步将IL-7转染SKOV3细胞作准备。方法:运用 一 RT.PCR技术从人脾组织中获取IL-7cDNA基因,与克隆载体PMD181连接构建 PMD181二L-7重组体,用 BamHI及Hindlll双酶切 pBK-CMV和 PMD18。T-IL7,将 酶切后的 IL-7和 pBK-CMV连接起来构建 hIL-7原核、真核双相表达重组体 pBK-CMV-IL-7,进一步用考马斯亮蓝染色法检测 pBK-CMV-IL-7在原核细胞 DHS a 中的表达。结果:成功获取人IL-7CDNA 基因,经测序证实对码,序列无误; PMD18-T-IL-7和 pBK-CMV-IL-7重组体经PCR和酶切鉴定证实几-7已克隆进表达载 体;经IPTG诱导后,行全菌SDS-PAGE,结果见重组体转化菌株在45KD处有增强 条带。结论:从人脾组织成功构建了人 IL-7克隆重组体 PMD-T-IL-7;利用上述重 组体,成功构建了人IL-7原核、真核双重高效表达重组体pBK-CMV-IL-7,其可在 大肠杆菌 DHS a中,经 IPTG诱导;产生 45KD左右的融合蛋白。 第二部分 稳定表达几-7的SKOV3细胞株的建立 目的:将IL-7cDNA基因转染SKOV3,观察IL-7基因转染前后肿瘤细胞IL-7mRNA 及蛋白的表达,建立稳定表达IL-7的SKOV3细胞株。方法:用脂质体介导法将 pBK-CMV-IL-7基因转染 SKOV3,行 G4旧筛选,并用 RT-PCR、Western Blot及 ELISA 法测定转染后pBK-CMV、IL-7重组体在SKOV3细胞中mRNA和蛋白的表达,同时 以转染空载体pBK-CMV为对照。结果:1.换用选择性培养基后,大部分转染 pBK-CMV-几。7及pBK。CMV的 SKOV3细胞(分别用 SKOV3-IL7和 SKOV3-Neo表 示)在1周后死亡,少数转染细胞继续生长增殖,SKOV3-IL-7细胞在选择培养基中生 长16周仍有抗性,而未转染的SKOV3细胞则在1周后完全裂解死亡。2.基因转染 后8—12周,SKOV3、IL-7、SKOV3.Neo及SKOV3细胞抽提的总RNA,经DNase消 化后,直接PC民未出现IL-7(639hP)及pBK-CMV(226hp)的条带,而以IL-7为引 物的RT-PCR,SKOV3-IL-7细胞出现639hp的阳性条带,SKOV3-Neo及SKOV3细 胞未见阳性条带。以pBK-CMV为引物的RT-PCR,SKOV3-IL、7细胞出现865hp的阳 性条带,SKOV3-Neo出现226hp的阳性条带,SKOV3细胞未见阳性条带。3.基因转 染后10周,SKOV3-IL、7、SKOV3-Neo及SKOV3细胞经裂解后的蛋白,经IL7的 Western blot分析,发现 SKOV3-IL-7细胞有阳性条带出现,而 SKOV3.Neo及 SKOV3 细胞未见阳性条带。经ELISA测定,SKOV3-IL7细胞上清的IL-7分泌量为:50~ 2 浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文 310pg/ffil/10‘/24hr,而 SKOV3-Neo及 SKOV3细胞上清中未能检测到 IL-7的分泌。 结论:利用脂质体作载体可将IL-7CDNA导入SKOV3细胞;选择培养后的SKOV3-IL-7 细胞能稳定表达 几-7mRNA和蛋白,即建立了IL-7 稳定表达的卵巢癌细胞模型 SKOV3—IL—7。 第三部分 几-7基因修饰的SKOV3细胞的生物特性、兔疫原性和体


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