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茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统研究

赵东  
【摘要】: 茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物之一。 茶叶富含多种次生代谢产物,其中多酚类物质具有多种重要的生理功能, 在食品和医药等行业具有巨大的应用潜力。多酚氧化酶与茶叶加工密切 相关,不同的茶叶类型需要不同的多酚氧化酶活性,如加工红茶的品种 需要较高的酶活性,而生产绿茶则希望有低的酶活性。本项研究重点在 茶树多酚氧化酶基因的克隆和茶树遗传转化系统方面,结果如下。 根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列,设计兼并引物,利 用nest-PCR技术,首次在茶树中克隆了多酚氧化酶基因。该基因已经在 GenBank上登录,登录号为AF269192。序列分析表明,茶树多酚氧化酶 基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子的 结合部位,所有的植物基本上一致。进化树分析表明,茶树的多酚氧化 酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。 通过对茶树茎培养的激素水平和相互关系的研究,以叶片数为生长 指标,初步明确了茶树茎培养所需的激素条件。统计结果表明,NAA和 BAP的浓度对培养材料的影响很大。在培养的早期,不同浓度的NAA 对茎生长作用效果不甚明显,未达到统计上的显著水平。但随着生长的 进程,NAA的浓度效果逐渐显现,即不同浓度的NAA对生长的影响显 著不同,在统计上达到极显著水平。与NAA的作用效果不同,不同的 BAP浓度对茶树茎生长的作用一直有着极显著的效果差异。同时通过统 计分析还首次发现了NAA和BAP对茎的生长没有互作作用。研究表明, 茶树茎培养的较为适宜的生长调节剂浓度为BAP 2.5-5mg/L、NAA 0.5-1 mg/L,在这个浓度条件下,经过60天的培养,一个茎最多可生长到15 片叶片。 我们以GUS的瞬间表达为指标,对根癌农杆菌介导的茶树转化系统 l 的影响因子进行了研究。由于 30 ml/L的卡那霉素即能够有效地抑制茶 l 树叶片愈伤组织的发生,因而对以 Kan为筛选标记的表达载体来说, 150mg/L Kan是较为适宜的选择浓度。我们比较了三种不同染色体遗传背 D 景的根癌农杆菌对茶树叶盘的侵染情况,发现侵染效果的差别不大。在 l 侵染过程中采用真空处理反而会降低GUS的瞬问表达。从试验结果看, l 茶树较为适宜的根癌农杆菌转化系统是用 ODm。为 0.5刀.8的 LBA4404 D 侵染茶树叶盘 10分钟左右,在暗中 28T共培养T3天。硝酸银对农杆菌 D 生长有抑制作用,不宜在共培养阶段添加。


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