高三尖杉酯碱通过影响信号传导途径和基因调控作用诱导T－淋巴细胞白血病细胞凋亡

【摘要】： [目的]高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）是从我国特有的植物海南粗 榧分离的有效抗癌药物。我国在世界上首先用于急性非淋巴细胞白血病（ANLL）的 临床治疗，疗效显著，HHT对慢性髓细胞性白血病同样有效。近年，国内外对HHT 的作用机制的研究发现HHT有抑制蛋白合成、克隆形成以及诱导细胞分化的作用； 对~3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入DNA也有影响。研究还发现HHT能促K562细胞 c-myc基因上调，启动凋亡；在凋亡后期能使c-fos基因表达增加，表明HHT促细 胞凋亡是受基因调控的。HHT在体外能诱导HL-60、K562和Jurkat细胞的细胞凋 亡，但未进一步阐述其促凋亡的机理。迄今，人们对HHT促凋亡作用限于髓系白血 病的研究，而HHT作用于T淋巴细胞白血病的促凋亡及其机理研究尚未见报道。 通过对HHT致白血病细胞凋亡的研究，将有助于深入地了解化疗药物对肿瘤细 胞凋亡及其信号传导途径的调控，为进一步提高HHT的临床疗效，扩大HHT的临 床应用范围提供理论依据和研究思路。 [方法］ 1 应用流式细胞仪技术、末端脱氧核糖核酸片段标记和细胞染色方法，研究HHT 浙江大学博士学位论文 促人 T－淋巴细胞白血病细胞株 Molt3（P53“）、MO卜16（P53”）、Ichikawa（P53”’）、 Jurkat（P53”’）和 HL－60（P53－）细胞凋亡、细胞周期的改变及其与抑癌基因 P53的 关系。 2 流式细胞仪检测细胞APO表面抗原表达及抗FAS和抗FAS配体作用后的凋 亡、检测线粒体膜电位的改变、ROS产生和抗氧化剂的作用；比色法检测caspase－3 活性及caspase－3－8、－9抑制剂影响HHT对线粒体膜电位改变和细胞凋亡。 3 半定量逆转录酶－多聚酶链式反应检测 HHT对细胞内 Bax和 Bcl－2 mRNA表达 的调控。 4 通过共聚焦激光扫描显微镜分析，线粒体示踪剂 Mito Tracker、Bax和细胞色素 C单克隆抗体及与带有荧光cy－5的羊抗鼠u抗作用，研究Bax和细胞色素C在HHT 作用前后的细胞内的定位。 ［结果］ IHHT能诱导T－白血病细胞凋亡，具时间和剂量依赖性，且与P53存在形式相关， 影响细胞周期，阻滞细胞在 GI期 HHT（Zn旮l、10nyml、25 nyml、50 n旮ml）分 别作用于 Mort3（P53“）、Moltl6（P53“）；Ichikawa（P53”’）、Jurkat（P53”’）细胞 和 HL－60（P53－）24小时，Molt3、Moltl6细胞凋亡率随着剂量加大凋亡率增加；Ichikawa 和 Jurkat细胞在 HHT相同剂量时的凋亡率比 Molt3、Moltl 6f氏午值分别＜0刀5）； 而H卜60细胞经HH T作用后，其凋亡率明显低于M。1G、讪1在16 o值分别＜O刀5）， 与 Ichikawa和 Jurkat的凋亡率无明显差异厂值分别＞0刀5）。将不同浓度 HHT分别 作用于 Molt3细胞 6、12、18、24小时，其凋亡率随着时间延长而增加。 2 HH”H不影响FAS受体／配体（FAS－R／FAS－L）对Molt3细胞的凋亡诱导作用 HHT作用MOlt－3细胞后的相对荧光密度显示，HHT无诱导FASK表达增强作用； 细胞经抗人FAS单抗CHll作用后，显示凋亡，但HHT对CHll无协同或增强作用； FAS配体中和抗体（NOKI、2）对 HHT作用的细胞凋亡无任何阻断作用。 2 一 3 HHT作用后细胞线粒体膜电位（么wm）的改变 荧光染料 JC＊显示线粒体膜 电位的存在和下降。当 MOltS细胞经 HHT 25n咖1处理12h后，线粒体膜电位下降， 荧光发散由 3％增加至 42％，与细胞凋亡的百分率相近，推测 HHT诱导细胞凋亡是 与线粒体膜电位下降有关。 4 HHT作用后细胞内细胞色素 C定位的改变在未经 HHT处理的细胞内，细胞色 素 C位于线粒体内，HHT 25ng／il处理细胞 12h后则弥散地分布在 Annexin－V阳性 的早期凋亡细胞的胞浆内。 5 HHT通过激活 caspasel诱导细胞凋亡 在 HHT10ng／ml和 50pgipl水平，可观 察到Motr3细胞的caspase〕活性随着剂量加大而增强，同时，casPase〕活性也随 着 HHT作用时间延长而随之增加。用 caspase上、8、－9特异性抑制齐 Z－DEVD－FKK。 Z．IETD－FMK ＄［IZ．LEHD．FMK先于 HHT与细胞作用，发现 CSSp＆SC－3、－8、－9抑 制剂均能不同程度地抑制 Molt3细胞的凋亡；经caspasel抑制剂处理后，能部分抑 制 HHT处理后的 Ichikawa细胞凋亡，而 caspase｛、刁抑制剂无抑制作用；结果还 发现么mm几乎不受caspase上、七、习抑制剂影响。说明八pm在casPases作用的 上游；但caspase－8、－9抑＄剂言抑伟casnase3的活性，表明casPase－3在casPase－8、 －9的下游。 6 HHT处理的细胞有活性氧（ROS）产生 抗氧化剂 NAC预处理细胞，可观察到 NAC能减少ROS的产生。然而，抗氧化剂并不影响HHT对线粒体膜电位及CCPCSS 3活性，也不抑制HHT诱导的细胞凋亡； 7 Bcl－2、BAX mRNA表达与 HHT的作用的关系 HHT能上调 Molt3细胞BAX 表达、下调 Bc1E表达；IChik洲。细胞 BAX、BCI工的表达在 HHT作用前后未发生 改变： 8 B盼在HHT诱导细胞凋亡过程的表达和细胞内定位 经HHT 25ng／ffil作用12h 后，BSX即易位到线粒体内。细胞