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高三尖杉酯碱诱导原代白血病细胞凋亡、相关机理及临床意义

孟小莉  
【摘要】: 高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)是从我国特有植物海南粗榧分离出 来的一种有效抗癌药物。我国在世界上首先用于急性非淋巴细胞白血病(ANLL) 治疗,并取得显著疗效。本研究探索HHT体外诱导原代急性白血病(AL)细胞凋 亡与临床疗效的关系,HHT促凋亡过程中,可能与端粒酶逆转录酶(hTERT)、端 粒酶和凋亡相关基因survivin表达密切相关。 本研究采用MTT法研究HHT对37例初发AL细胞(ALL 11例,ANLL 26例) 体外培养15小时的抑制作用。结果发现:HHT对ALL细胞抑制率明显低于ANLL 细胞(19.68±18.83对34.92±19.58,P<0.05)。37例AL患者(除外M_3)中20 例可资评价临床疗效,采用TUNEL法检测HHT的促凋亡作用,结果发现,HHT 诱导ALL细胞凋亡率略低于ANLL细胞(17.34±9.60对26.64±20.67, P>0.05)。原代AL细胞体外凋亡率(根据化疗方案取HA或DA,ALL患者取DNR) 与骨髓原始细胞减少指数(MBDI)密切相关(γ=0.586,P<0.01)。AL细胞体外凋 亡率中位值为27.6%,AL细胞体外凋亡率>27.6%者,CR率为80.0%(8/10),凋亡 率<27.6%者,CR率为30%(3/10),差异具有统计学意义(P=0.03)。采用HA方案 化疗患者中,体外调亡率>27.6%的患者,CR率也高于凋亡率<27.6%的患者 [80.0%(4/5)对25.0%(1/4)]。表明AL细胞体外凋亡率与体内疗效基本一致,体 外凋亡率可以做为预测AL疗效的指标之一。 本研究采用半定量RT-PCR方法检测30例初发AL,12例AL获CR患者、6 浙江大学博士学位论文 例正常人骨髓细胞hTERT mRNA的表达。结果显示:初发AL细胞hTERT mRNA 表达量为0.71士0.34,明显高于*组的hTERTmRNA表达量0.43士0.25(P<0.05) 及正常骨髓细胞hTERT mRNA达量0.22士0.21(P<0.01)。采用端粒重复序列扩增 法(TRAP)-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测端粒酶活性,结果显示 30例初发 AL 细胞端粒酶活性明显高于12例CR 患者(0.235士0,395 对0.012士0.015, P=0.007)。30 例初发 AL 细胞 hTERT mRNA 表达量与端粒酶活性呈正相关 (r=0.421,p<0.of)。结果表明端粒酶活性与hTERT表达相关。 本研究结果还显示:HHT能够下调 hTERT mRNA表达。不同浓度 HHT作用 HL60 细胞 12小时,与空白对照比较,HHT浓度在 0刀05ug/ffil-0.03t。g/ffil之间对 HL60 细胞 hTERT mRNA表达无明显影响,HHT浓度增至 0刀4ugiml-0.05ug/ml,hTERT mRNA表达量明显下降至检测不出。0刀Zug/ml HHT作用 HL60细胞不同时间后,开 始 6小时内 hTERT mRNA表达无明显变化,>6 ’J’时后,hTERT mRNA表达量呈 下降趋势,18小时后明显下降,至 30小时未能检出 hTERTmRNA的表达。结果 显示,HHT能够下调hTERT mRNA表达,但需一定的浓度和作用时间。与此同时 研究了HHT对HL60细胞端粒酶活性和凋亡的影响,显示HHT能使HL60细胞端 粒酶活性-卜降,其下降趋势与 hTERT mRNA表达基本一致,且随 hTERT mRNA转 录水平和端粒酶活性下降,HL60细胞凋亡率明显增加。推测下调白血.病细胞hTERT 转录和端粒酶活性可能是HHT诱导白血.病细胞凋亡的原因之一。 HHT诱导原代AL细胞凋亡与抗凋亡基因 survivn mRNA表达有关。本研究采 用RT-pCR方法检测初发AL细胞suvivin mRNA表达。结果发现:survivin mRNA 在AL细胞阳性率为82.口%(41乃0),明显高于正常对照33.3%(2峋(P<0刀5);其 表达强度也高于正常对照(0.45上0.27 对 0.11士0.17,P二0.004)。ANLL各亚型 中,叭细胞survivin mRNA表达阳性率明显低于 M;_。和 M。_。…值分别为 0.of, 0.035)。survivin mRNA阴性的患者接受一个疗程的化疗后骨髓缓解率(BMR)明显 高于阳性组【83.3%(5/幻 对25.0%(4/16),P=0.0231。体外实验表明,1 例 survivin mRNA阴性表达的AL细胞对HHT诱导凋亡率,均高于14例阳性表达者。 体内疗效显示,13例接受HA方案化疗患者中,survivin mRNA阴性表达者BMR率 高于阳性表达者[100%(2/2)对 27.3%(3/11)]。推测:AL细胞 survivin mRNA 表达可能是其对HHT诱导凋亡不敏感的原因之一,未见相关文献报道。 2 浙江大学博士学位论文 综上所述,本研究认为:()HHT对原代 ALL细胞和 ANLL细胞均有抑制作用 和诱导凋亡作用。()AL细胞体外凋亡率与 MBDI相关,可以作为预测 AL临床疗 效的指标之一。()原代 AL细胞 hTERT mRNA表达与端粒酶活性相关,AL获 CR 后,hTERT和端粒酶活性同步下降,国内未见相关文献。(4)HHT能够诱导 HL60 细胞hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性下降(未见相关文献)。诱导hTERT表达 下降可能是HHT诱导白血病细胞凋亡原因之一。(5)本研究首次发现抗凋亡基因 survivin mRNA在AL细胞高表达。survivin mRNA高表达可能是AL细胞对HHT 诱导凋亡不敏感的原


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