收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒p40、chi基因克隆及chi基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

武家才  
【摘要】: 本文通过建立了棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) Cl株基因组文库,并对一些克隆进行限制性内切酶分析、Southern杂交和序列测定鉴别出 了编码p40基因全序列的HindIII-H、J片段及编码几丁质酶基因的HindIII-E片段,进 一步分析了p40基因序列和几丁质酶基因序列,并在大肠杆菌和昆虫细胞中表达了几丁质 酶基因。 在棉铃虫虫体内增殖了HaSNPV Cl株,从提纯多角体中提取基因组DNA。应用BamHI、 EcoRI、EcoRV、HindIII、PstI、XbaI和XhoI 7种限制性内切酶分别将基因组DNA完全酶 切,条带数分别为11、19、22、13、6、16和5。以λDNA/HindIII酶切片段作为分子量标 准,求得各片段的长度,推测出HaSNPV基因组大小为130kb左右,进一步选用HindIII、 XbaI、XhoI、HindIII+XbaI、HindIII+PstI、HindIII+XhoI完全酶切基因组DNA,构建了 HaSNPV基因组文库。 用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI四种限制性内切酶分析基因组文库中的克隆,筛选 出了基因组HindIII-E、H和J片段,其长度分别为10.6、10和6.7kb。对H和J片段末 端测序得到HaSNPV p40基因全序列,HindIII-H和J片段分别编码其上游和下游序列。HaSNPV p40基因编码区全长966bp,与HzSNPV p40基因有98%的相同性,其翻译起始位点上游都 有一个保守的晚期转录起始位点ATAAG。从HaSNPV p40基因核苷酸序列推测其编码蛋白分 子量为36.58kD,其氨基酸序列与BmNPV p40和AcMNPV gp41的氨基酸序列相同性为55% 左右,但HaSNPV p40的28-277氨基酸区域与SeMNPV、LdMNPV、AcMNPV、BmNPV、OpMNPV 的同源基因相对应区域比较,相似性在60%以上,并且七种基因中存在3个保守的半胱氨酸。 对以上七种同源基因编码的氨基酸序列分析,结果表明P40蛋白溶解性都低于30%。进一步 绘出了七种杆状病毒P40蛋白进化树。 在对HaSNPV基因组HindIII-E片段限制性内切酶分析基础上,通过建立该片段随机 克隆,测定了E片段全序列。该片段含有完整的、以ATG为起始密码子、编码多肽不少于 50个氨基酸的ORF 9个,其中包括编码几丁质酶基因的ORF。HaSNPV几丁质酶基因编码区 全长1713bp,推测编码蛋白分子量为65.5kD,与HzSNPV几丁质酶基因编码的氨基酸序列 有91%的相同性,与BmNPV和AcMNPV几丁质酶基因编码的氨基酸序列相同性为66%,与粘 质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶A(chiA)基因编码的氨基酸序列相同性为 55%。HaSNPV几丁质酶对应于S. marcescens chiA的催化区域有73%相同性、86%相似性。 HaSNPV几丁质酶对应于S. marcescens chiA纤粘连蛋白III型组件结构区域相同性达41%, 相似性为58%。通过与HzNPV几丁质酶基因编码氨基酸序列比较识别出其N端有一个由20 个疏水性氨基酸组成的假定信号肽序列,C端有一个假定的内质网保留信号序列HNEL。 根据HaNPV几丁质酶基因5’端编码信号肽序列的假定,从基因组HindIII-E片段中 扩增了HaSNPV几丁质酶全部编码区基因(chi)和HaNPV缺失假定信号肽的几丁质酶的编码 区基因(chjs人习Chf。Chjs书其阅读框构建到pErl’28a载体中,得到pETchi、pETcllis- 两个表达克隆。pETchi、pEI’chis-转入大肠杆菌皿3中诱导表达,通过SDS-PAGE及Western 印迹检测,确定表达出分子量为60kD人右的蛋臼。 将PCR扩增出的HaSN* chls-基因构建到杆状病毒-昆虫表达系统的供体质粒 pFASTBACHTa中,通过转座作用将目的基因重组进穿梭载体Bacmid中,重组Bacmid在 LIPfectin介导下共转染粉纹夜蛾细胞.连续传代感染四次后,PCR检测到细胞中含重组有 目的基因的病毒,对感染细胞进行SDS干AGE分析,表明有特异性表达条带,其分子量为60M 左右。 本论文的创新点主要有: 1.首次克隆分析了flaSN。V vio基因,井确定了11aSNPV基因组 /llndlll-11. J片段的 精确物理图谱。 2.克隆了包含几丁质酶基因的 IlaSNPV基因组 Ijlndlll{片段,测定了 E片段全序列。 3.在大肠杆菌中高效表达了HaSNPV儿丁“质酶基因及缺失假定信号肽的几丁质酶基 因。 4.在昆虫细胞中高效表达了llaSNPV缺失假定信号肽的儿丁质酶基因。 本文尤其较系统研究了!laSNPV几丁质酶基因,为进一步的应用研究提供了基础


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 冯立娟;苑兆和;尹燕雷;李自峰;张克群;;美国红枫变色期苯丙氨酸解氨酶与查儿酮异构酶变化研究[J];山东林业科技;2008年05期
2 田晓艳;刘延吉;;脱落酸对南果梨色素及部分合成关键酶的影响[J];北方园艺;2008年12期
3 刘延吉;王嵩;吕德国;田晓艳;王学密;;ABA对南果梨花色素含量、合成酶及信号分子的影响[J];沈阳农业大学学报;2009年01期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 简桂良;邹亚飞;刘慧君;;导入Chi基因对抗虫棉各种农艺性状的影响[A];中国植物病理学会第六届青年学术研讨会论文集——植物病理学研究进展(第五卷)[C];2003年
2 刘关君;刘昌财;刘明坤;魏志刚;刘桂丰;;西伯利亚蓼几丁质酶基因Class IV的克隆及生物信息学分析[A];第六届全国林木遗传育种大会论文集[C];2008年
3 袁政涛;陈锦辉;杨红;吴健辉;王春峰;焦俊鹏;;上海隧桥工程海域生态系统健康的初步评价[A];2008年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前8条
1 韩瑞霞;苦荞种质遗传多样性与CHI基因多样性分析[D];山西大学;2012年
2 田家欢;彩色棉纤维色素相关基因的表达差异及CHI基因的克隆与分析[D];四川农业大学;2011年
3 杜幸原;汉语量词“个”与越南语“Chi(?)c,cái”对比研究[D];湖南大学;2013年
4 王庆菊;李属红叶树种叶片花色苷合成规律及影响因素研究[D];山东农业大学;2007年
5 钱丹丹;大豆CHS8、CHIⅡ、SAI融合基因的原核表达及植物表达载体构建与转化[D];吉林大学;2011年
6 乔中全;金银花chs、fls、chi基因全长克隆及序列分析[D];中南林业科技大学;2012年
7 许鑫科;两种彩叶植物叶色表达相关机理研究[D];山东农业大学;2010年
8 刘淑慧;蓝莓果实关键品质形成机理以及蔗糖、钾对其影响研究[D];北京林业大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 王文芳;他们叫我“Mr.china”[N];中国消费者报;2000年
2 本报记者 张洵涛;chinagc成为2000中国国际旅交会上的亮点[N];中国旅游报;2000年
3 申彦;商旅通(www.chinaAce.com)专业性与实用性的统一[N];中国旅游报;2000年
4 薛礼;点击十大网站“死穴”(下)[N];国际商报;2000年
5 冬眠的蝉;做IT人 看IT新闻[N];中国电脑教育报;2002年
6 NetValue公司;招聘网站“招”来哪些人?[N];网络世界;2001年
7 本报记者 高翔;天底下最肥硕的“狐狸”[N];深圳商报;2000年
8 记者 王燕枫;中国日报网站推出IT频道[N];新闻出版报;2000年
9 记者 陈正红;电子商务:口好开曲难唱[N];国际经贸消息;2000年
10 本报特派记者 刘颖余;中国人成了“明星”[N];工人日报;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978