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人白血病相关逆转录病毒的分子克隆与鉴定

徐荣臻  
【摘要】: 研究背景 白血病是造血组织常见的恶性肿瘤。迄今为止,大多数人类白血病的病因 与发病机理仍未明了。由于动物白血病和成人T淋巴细胞白血病的逆转录病毒 病因学早已得到证实,其它类型的白血病曾经被怀疑是由病毒感染所致。然而, 与这些白血病相关的病毒却一直未能得到分离和鉴定。我们以往的初步实验及 其他一些研究结果提示,除了成人T淋巴细胞白血病以外,大多数其它类型的 白血病的发生可能与逆转录病毒感染有关。本研究的目的是应用系列新的研究 策略直接从各种不同类型白血病病人的原代白血病细胞中分离和鉴定这些逆 转录病毒。逆转录病毒与人类白血病的关系一旦得到明确,那么就有可能给人 类白血病的诊断与防治方面带来新的思路。 第一部分人自血病细胞中逆转录病毒颗粒和病毒蛋 白的研究 材料和方法 逆转录病毒颗粒形态学与超微结构鉴定 应用电子显微镜技术观察和分析病毒颗粒形态学和超微结构。 白血病细胞和正常血细胞中逆转录病毒蛋白的检测与分析 应用免疫细胞化学染色技术和 Western blot技术及对逆转录病毒蛋白特 异的单克隆抗体pl5E检测和分析白血病细胞和正常血细胞中的逆转录病毒蛋 白。 逆转录病毒致细胞病变观察 在倒置显微镜下通过观察合胞体形成来评价逆转录病毒对血细胞的致细 胞病变作用(CPE)。 原代白血病细胞中逆转录病毒颗粒的分离和鉴定 逆转录病毒颗粒通过诱导体外培养原代白血病细胞产生。白血病细胞用 含有新生小牛血清和造血生长因子的RPMll640培养基培养。应用低温超速 蔗糖密度梯度离心方法从白血病细胞培养上清液中分离和纯化逆转录病毒颗 粒(10,0009 X 18hr,4oC)。 逆转录酶活性测定 逆转录病毒颗粒逆转录酶活性测定采用经典的放射性同位素掺入法。 逆转录病毒颗粒蛋白谱分析 采用 SDs聚丙烯酚胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和 Western blot技术分析。 结果 白血病细胞和正常血细胞中逆转录病毒颗粒检测和鉴定 观察病毒颗粒不仅能提供逆转录病毒感染直接证据,而且还能明确病毒颗 粒是否具有自我复制能力和感染其它细胞的能力。本研究应用透射电镜技术仔 细检查经诱导过的白血病细胞和正常血细胞超薄切片中的逆转录病毒颗粒。检 测结果表明,在未经诱导的10份新鲜白血病细胞中,有2份白血病细胞可见 典型的逆转录病毒颗粒。20份经诱导后的白血病细胞样本均可见典型的逆转录 病毒颗粒,而10份经诱导培养的正常血细胞样本中未见类似的逆转录病毒颗 粒。根据病毒颗粒形态学特点及病毒颗粒出芽方式,这些病毒颗粒属于C型逆 转录病毒颗粒,含有完整的病毒RNA基因组。 逆转录病毒蛋自在白血病细胞和正常血细胞中的表达 跨膜蛋白pl5E是逆转录病毒结构基因env编码的免疫抑制蛋白,在大多 数逆转录病毒中呈高度保守。为了寻找白血病患者逆转录病毒感染依据,本研 究应用兔疫细胞化学染色技术和逆转录病毒特异的单克隆抗体pl5E观察各种 不同类型白血病病人的白血病细胞和健康人的正常血细胞表达逆转录病毒蛋 白的情况。研究结果表明,在 31例白血病病人的新鲜白血病细胞样本中有 25 例表达逆转录病毒蛋白,阳性率为 80.65%(25/31)。而在 20份正常血细胞样 本中,无一例表达逆转录病毒蛋白。Western blot结果显示,在白血病细胞蛋 白提取液中含有两种能与单克隆抗体反应的逆转录病毒蛋白,其分子量分别为 74KD和 24KD。但在相应正常血细胞蛋白提取液中未能检测到这两种蛋白。 逆转录病毒诱导血细胞合胞体形成的观察 合胞体形成是逆转录病毒感染引起细胞病变的特征之一。为明确白血病细 胞中逆转录病毒能否引起血细胞病变,本研究通过仔细观察细胞培养过程中合 胞体形成情况来评价逆转录病毒对白血病细胞作用。结果如实验前所料,白血 病细胞在体外诱导培养后的第四天开始出现典型的具有多核巨细胞的细胞病 变表现,而相应正常血细胞未见明显合胞体形成。这一结果提示,白血病细胞 中的逆转录病毒对人白血病细胞具有致细胞病变作用。 逆转录病毒颗粒的分离和鉴定 为进一步阐明人原代白血病细胞中逆转录病毒颗粒的特征,本研究先从白 血病细胞培养上清液和培养后的白血病细胞中纯化出病毒颗粒,然后用电镜技 术和分析逆转录酶活性来研究这些病毒颗粒特性。电镜检查结果表明,白血病 细胞和培养上清液中均含有典型的C型逆转录病毒颗粒,其形态学特征类似于 白血病细胞超薄切片中观察到的逆转录病毒颗粒。对该病毒颗粒理化特性分析 发现,病毒颗粒在蔗糖介质中的浮密度为 1.15*.19g/cm\病毒逆转录酶对放 线菌素D不敏感,其活性依赖于二价阳离子,Mn””的活性高于Mg“”。这些 结果表明,人白血病细胞中的逆转录病毒颗粒不同与已知的成人T淋巴细胞白 血病病毒(HTLV-I)。对照实验结果显示,正常血细胞培养物及培养上清中均 未检测到类似的逆转录病毒颗粒和逆转录酶活性,表


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