兔股静脉延迟移植内皮素一氧化氮一氧化氮合酶基因表达变化的研究

【摘要】： 自体血管移植在疾病的治疗中已广泛应用，尽管与人工血管相比，有其优越 性，但远期仍有30％～40％的狭窄率，为业内专家所关注，因此如何防止移植血 管的狭窄也同时成为血管外科研究的热点。一氧化氮（Nitric oxide，NO）自1987年 研究证实是一种气态内源性生物信使，1992年被“science”杂志评为年度分子。 研究表明NO与周围血管的关系亦非常密切，NO能舒张血管，抑制血管平滑肌 细胞（VSMCs）的分泌和该系统的迁移，阻止单核细胞及血小板（PLT）的粘附与聚集 等。在体内NO由NO合酶（NOS）催化左旋精氨酸（L-Arg）中的胍基氮原子合 成。而NO合酶普遍被分成组成型（cNOS）和诱导型（iNOS）。其中cNOS mRNA 的表达是依赖Ca~(++)和Ca~(++)M（钙调素）的，其浓度在血管中很低且较为恒定。而iNOS 基因的转录和表达是受血流切应力的变化，致炎CD分子等诱导，一旦诱导因素 存在iNOS基因的表达的量高且持续时间长，而内皮素（endothelin，ET）作为与 NO相互拮抗的内源性分子，具有强烈的缩血管作用。本研究探讨移植已游离（但 未离断）的兔股静脉何时最佳即该段静脉局部的NO量高而持续时间长、ET量低， 以期最大限度地防止药物不能缓解的血管痉挛及远期移植静脉再狭窄。 本课题应用硝酸还原酶法测定NO。该酶特异地将NO_3~-还原为NO_2~-，NO_2与 显色剂作用生成有色物质，检测吸光度大小代表NO水平。较之单纯测定NO_2~-作 为NO水平有更高准确率。应用放射免疫法测定ET。本课题以RT-PCR法检测的 主要是iNOS mRNA。应用上述实验的结果推断自体血管移植宜在游离血管的即 时，还是在完成游离后延时2、4、8、24小时进行为妥。供临床应用时选择。 一 1．实验对象 血清标本取自浙大医学院动物中心提供15只雄性新西兰兔30条后肢之股静 脉回流血液，兔重22009土2009。 2．实验分组和模型建立 15只兔随机分成5组，每组3只，6条后肢。 2刁 即时移植组：游离股动脉（FA），股静脉（FV后，即刻抽取近心端 F V血后 一切断 FA、F V一立即行 F V—PA间置移植术。 2．2 延迟 2小时移植组：游离 FA、FV后一缝合各层一2小时后抽取近心端股静 脉血一并同时行FV－FA间置移植术。 2．3 4、8、24小时组以延迟二小时移植组类推。 3．实验方法 3．1 血液抽取 2％戊巴比妥钠兔耳静脉注射麻醉达成后（以30～50mg／kg的剂量），同时游离 双侧股动静脉，抽取FV近心端血液3ml，均分成三份，分别用于检测ET、NO、 NOS基因表达变化。延时2、4、8、24小时的组分别在游离股V后的这个时点抽 取，并同法分成三份。 3二 ET标本取材 lml血液抽取后迅速注入含 10％EDTA二钠 15 u！和抑肽酶 20 ul的试管中， 混匀，4oC，3000rpm离心 10min，分离出血浆，放－70oC冷藏。测定前，使样本置 于室温或冷水中复融，再次4C，3000rpm离心smin，取上清测定。 3．3 NO标本取材 lml血液抽取后，注入含 10％EDTA15 nl的试管中，混匀，4℃，3000rpm离 心 10min，分离出血浆，置－70oC冷藏。测定前使样本室温下复融，再次4oC，3000rpm 离心smin，取上清测定。 3．4 iNOS DNA标本取材 lml血液经淋巴细胞分离液提取出白细胞，离心后生理盐水洗涤白细胞 2次， 得到白细胞沉淀，置－70oC冷藏。 2 浙江大学硕士研究生论文 3．5 检测 ET；用放射免疫法测定ET NO：用硝酸还原酶法测定 iNOS基因：以RT－PCR法半定量测定。 4．统计学处理采用SAS－PC软件包进行数据统计分析，P＜0．05判定有统计学意 义。 5．实验结果 5l 所有取材均为有效标本。 5．2 ET含量的变化为：即时组为（275．7470士门．4009）u mol几，延时二小时组为 （40．1183t6。1109）umol／L，延时4小时为（423．9867士5．1791）umol／L，延时8’J’ 时为（381．4500土5．1203） u mol几。延时 24 ’J’时为（279．4017113，0889） u mo凡。即 时组与延时2、4小时组比较有统计学意义（P＜0．05），即时组与延时组sh比较有 统计学意义，即时组与24小时组比较有统计学意义（P＜0．05）。 5．3 NO含量的变化为：即时组为（ZI石575士1．4209）u mol几，延时二小时组 （11．2023士0。8761）umol／L，延时4’J’时组（11．2450士1．0419）utnol／L，延时8’J’时 组（2．7917if。0445）umol／L，延时24 ，J’时组O、2833士l．0968）umol＆。