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法夫酵母生物合成虾青素的研究

梁新乐  
【摘要】: 本文以法夫酵母(Phaffia rhodozyma)生产菌株,对生物合成虾 青素进行了较为详细的研究,以期获得虾青素高产菌株,优化的发酵 条件和分离制备工艺,为法夫酵母虾育素合成提供基础理论及生产实 践指导。 由于野生法夫酵母虾青素产率很低,通过化学诱变筛选出8株较 高虾青素产率的突变株。与出发菌株相比,此突变株虾青素产率提高 3倍,达1494.74μg/g干细胞。在耐温型突变株筛选中,挑出3株突 变株NPT-1、NPT-2和NPT-5,可在28℃生长,但只能合成虾青素前 体如beta-胡萝卜素等中间代谢物,而不能合成虾青素。 通过虾青素摇瓶发酵过程中初糖浓度、初始硫酸铵浓度、pH值、 培养温度、接种量、转速、装液量等的研究,得出了适宜的摇瓶培养 条件。法夫酵母能利用多种糖类作用碳源,其中纤维二糖最有利于虾 青素的积累。补加虾青素的前体物如胡萝卜汁和番茄汁也可显著提高 虾青素的产率,可分别达1800μg/g干细胞和1743μg/g干细胞,比 对照组(120μg/g干细胞)提高50%;而细胞干重增加不明显,这 表明前体物的添加显著促进了单位细胞虾青素合成。二甲基亚砜的萃 取发酵试验没有取得成功。 虾青素的合成与细胞生长是偶联的,因此流加培养成为探索法夫 酵母细胞高密度培养及虾青素合成的主要培养方式。通过恒速流加、 对数流加、恒pH流加(pH-stat)及恒溶氧流加(pO_2-stat)试验,结 果表明对数流加有较高的虾青素产率和细胞干重,分别达到17.12mg/l 和31.56g/l;对数流加和恒溶氧流加方式下虾青素对底物的转化率(Yp/s) 有最大值,3mg/g葡萄糖。通过补加虾青素前体番茄汁和胡萝卜素, 虾青素显著提高,分别达15.21mg/l和6.12mg/l,细胞干重分别为 10.72g/l和5.34g/l。 法夫酵母在以葡萄糖为底物生物合成虾青素的同时,还产生乙 醇;并以乙醇为碳源进行二次生长,虾青素的合成也表现出二次合成 现象。构建的数学模型很好地拟合了实验数据,较好地描述了法夫酵 母以葡萄糖为碳源时的二次生长和虾青素二次合成规律。 采用廉价、易得的发酵底物(碳源)供法夫酵母细胞生长及虾 青素的合成,是降低生产成本的一个主要措施。微晶纤维素和玉米芯, 一 经纤维素酶水解后,其产物都可被法夫酵母利用,用于细胞的生长及 虾青素的合成,最大细胞干重和虾青素分别为 2.70g/l、3.3mg/l。N米 糖化液作为发酵碳源时,细胞干重和虾青素产率分别达到4.35g/l和 3.4mgil。而釉米的糖化过程简单,成本较低,因此釉米糖液作为法夫 酵母生长及虾青素的合成具有较大潜力。 虾青素发酵是强好氧发酵,溶氧水平直接影响虾青素的积累。当 DO值在屯刀则至8刀mg/l时虾青素比生成速率有较大值。氧载体强 化氧传递是提高溶氧水平的一条新途径。添加豆油、正十二烷等氧载.回 体可提高虾青素发酵中的溶氧水平,并促进虾青素的合成。实验结果 还表明,po。在发酵20h左右时降至最低,此后迅速回升至60%(相 当于 5.omg/l人因此提出假设,在法夫酵母细胞内除存在一条常规的 电子磷酸化呼吸链,还可能存在另一条呼吸链,此呼吸链对氧比较敏 感,溶氧不足将导致其不可挽回的中断,从而影响法夫酵母虾青素的 合成。通过冷模体系的分析、建模及拟合曲线与实验数据的比较,表 明此模型能较好地反映在冷模体系中氧载体的添加对于体积溶氧系数 及传质推动力的影响。 通过薄层层析、柱色谱、紫外/可见光光谱、高效液相色谱、核磁 共振、质谱等实验,建立起了一套虾青素的分离、分析及制备的方法 及工艺路线。虾青素总收率达到66.71o。通过对突变株NpTd和NpT毛1 的类胡萝卜素成分分析,表明法夫酵母细胞内虾青素合成存在两条途 径。


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