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基因工程改良几种重要蔬菜的抗虫性

杨广东  
【摘要】: 大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)、甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)和辣椒(Capsicum annuum L.)是我国重要的三种蔬菜。目前,人们对无公害蔬菜的要求愈来愈强烈,在蔬菜生产中少有或不用化学药剂已成为世界农业关注的焦点。但是近年来菜青虫、小菜蛾、蚜虫等对十字花科蔬菜以及茄二十八星瓢虫、烟青虫、棉铃虫等对茄科蔬菜的危害有愈演愈烈的趋势,这使得生产中所施用化学杀虫剂的种类和数量也不断增加。化学杀虫剂不但杀死了害虫,同时也杀死了有益昆虫,破坏了自然生态平衡,其在自然界中的残留以及在食物链中的积累造成了严重的环境污染。由于在已有的种质资源中找不到可利用的抗虫材料,使得这几种蔬菜的常规抗虫育种受到了限制。利用基因工程技术手段培育抗虫蔬菜新品种是农业发展的一个重要方向,与传统的害虫防治相比,基因工程不仅具有选择性强、使用安全、投资少和见效快的优点,而且对于植物的保护具有连续性、全面性。 高效稳定的遗传转化体系的建立是获得转基因大白菜、甘蓝和辣椒的前提条件。实验研究了不同激素种类和添加物、不同基因型、不同苗龄和不同类型的外植体、预培与否、工程菌液浓度、侵染时间、共培养基pH值和共培养基中去掉微量元素Co~(2+)以及卡那霉素和头孢霉素浓度、添加乙酰丁香酮与否和添加时间等对大白菜、甘蓝和辣椒转化频率的影响,并对各影响因子进行了优化,初步建立了一套大白菜、甘蓝和辣椒高效稳定的遗传转化体系,使大白菜带柄子叶最高转化频率可达5.74%,甘蓝带柄子叶和下胚轴转化频率可达到3.17%和5.21%,辣椒的转化频率最高为16.5%。 利用根癌农杆菌法将Bt基因、修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)、雪花莲外源凝集素基因(gna)等单价抗虫基因以及Bt-cpti融合蛋白基因和Bt-cpti-gna三价抗虫基因导入了大白菜,甘蓝和辣椒中,同时经基因枪轰击将Bt-cpti融合蛋白基因导入大白菜和甘蓝茎尖,并获得了卡那霉素抗性植株。再生植株分别经PCR、PCR-Southern、Southernblotting杂交证实,外源抗虫基因已经整合到大白菜、甘蓝和辣椒的基因组染色体中;Northern blotting杂交证实,外源基因(Bt、sck和gna)在转基因植株体内已正常进行了转录;胰蛋白酶抑制剂活性和凝集素凝血活性分析也表明sck基因和gna基因在植株体内已正常表达,并具有一定的生物活性。研究发现,大白菜,甘蓝和辣椒转sck基因、Bt基因和gna基因的部分植株中检测不到外源目的基因的转录产物或转录产物强弱差别很大;胰蛋白酶抑制剂和凝集素凝血活性分析证明转sck基因大白菜、甘蓝和辣椒的不同植株,其CpTI相对表达量存在较大差异,部分植株的表达量与对照相似甚至还低于对照;转gna基因的部分大白菜和辣椒植株没有凝血活性或仅有很弱的凝血活性,这表明这些基因在转基因植株体内发生了基因失活现象,转录前失活和转录后失活都有发生。大白菜和甘蓝转基因植株与非转化对照相比,除自交结实率低外,其他性状如花期、株型、种子千粒重等没有差异,而且自交结实率低的原因是由组培因素造成;辣椒转基 博士论文 摘要 因植株与对照在农艺性状方面没有差异。 公 菜青虫和棉铃虫室内喂饲转Sob基因、Bt基因、Bt-Cpri融合蛋白基因和B仰ri侧 三价基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株叶片的结果表明,转基因植株具有一定程度的抗性, 室外自然抗虫性观察也证实部分转基因植株具有较高的抗虫性。室内和室外蚜虫抗性实 验证明转聊基因和BtCp打哪口三价基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株具有一定的抗蚜性, 大白菜最高抑制蚜虫率在 32.6%,甘蓝最高为 39.5%。研究发现,不同基因转化而来的 转基因植株之间以及同一基因转化而来的转基因植株之间抗虫性差异很大,大白菜和甘 蓝转*仁…融合蛋白基因和m基因的再生植株抗虫性高于转SCk基因的植株,转 Bt-Cp打o三价基因的辣椒植株在所有转基因植株中抗虫性最好。抗虫性分析证实,转 SCk基因的大白菜、甘蓝和辣椒植株的抗菜青虫能力与其体内CpTI含量存在着一定的相 关关系。在质粒pC肚SBCK-OMGNA中由三个重复的章鱼碱合成酶基因*CS)上游增强 序列及甘露碱合成酶基因(MAS)启动子组成的高效复合OM启动子驱动下的聊基因 比在质粒pBinGNA中由 CaMV 355启动子驱动的岁叨基因更高效地表达,这在转 Bt-Cpn侧三价抗虫基因的大白菜或甘蓝植株中有部分植株的抗蚜性极明显高出转卵 ”基因植株得到体现。 以“GPllS刀7”和“ZB七-04”二个转Sob基因大白菜飞代株系为实验材料,研究 了新霉素磷酸转移酶基因(叩*)和修饰的虹豆胰蛋白酶抑制剂基因bCk)在L代的 遗传规律及表达特性。结果表明:转SCk基因大白菜TI代植株经卡那霉素室内种子筛选、 室内叶片筛选以及室外叶片筛选等均证实叩ill基因可以稳定遗传和表达,其中 “GPll.S.07”株系中卡那霉素抗感比为4.26-


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