收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

中华蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2和透明质酸酶基因的克隆与表达

沈立荣  
【摘要】: 蜜蜂蜂毒(honeybee venom or Bv,下称蜂毒)是重要的蜂产品和古今中外应用广泛的天然药物,具有重要的开发利用价值。蜂毒磷酸脂酶A_2(BvPLA_2)和透明质酸酶(BvHya)是蜜蜂蜂毒的2个主要功能性蛋白,是医学、细胞分子生物学研究等方面具有重要价值的有效药用成分和工具酶,也是具有杀虫和抗菌作用的生物活性成分。本论文开展了中华蜜蜂(A.cerana cerana,中蜂)、意大利蜜蜂(Apismellifera,意蜂)蜂毒磷酸脂酶A_2和透明质酸酶基因的克隆与表达研究。 (一)中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因的克隆与表达 首先用RT-PCR方法克隆成功了中蜂蜂毒磷酸脂酶A_2(AcPLA_2)和意蜂蜂毒磷酸脂酶A_2(AmPLA_2)的成熟肽编码区基因,测序结果表明,二者的核苷酸序列全长均为405bp,所编码的多肽均为134氨基酸残基,推测二个多肽的分子量分别为14.7kD。对7种生物PLA_2氨基酸序列联配结果,AcPLA_2与AmPLA_2、大蜜蜂PLA_2、美国熊蜂PLA_2及黑腹果蝇PLA_2的同源性分别为95%、90%、54%、39%,AcPLA_2与家猪胰PLA_2和响尾蛇蛇毒PLA_2的同源性均只有13%,表明AcPLA_2与AmPLA_2的同源性最高。从7种生物的PLA_2分子系统树可见,AcPLA_2与AmPLA_2的进化距离最近。氨基酸序列分析结果表明,AcPLA_2与AmPLA_2具有相同的酶活位点、二硫键位点和Ca~(++)结合位点,在分子结构与功能上反映出很高的同源性和保守性。AcPLA_2属首次报道的基因序列,也是首个报道的中蜂基因序列,已作为新的基因序列在GenBank登录(登录号AF321087)。 将克隆到的AcPLA_2与AmPLA_2基因作EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后 浙江大学博士学位论文 中文摘要 pBacFastHTa 质粒的相应的多克隆位点中,获得重组杆状病毒供体质粒 pBacHT-AcPLAz和pBacHTAmPLA)然后分别转化大肠杆菌DH10Bac,经抗 生素和蓝白斑双重筛选,PCR 鉴定,获重组病毒B跳ffiid叭 和 Bacmid-AmPLAz。在无血清条件下,用 Lipofectin介导 Bacmid-AcPLAz禾 Bacmid Am P*AZ的基因组0*A转染生长状S《‘j态良好的粉纹夜蛾细胞TZ七B卜4后,分别 从被二者感染的Tn细胞抽提病毒DNA进行PCR检测,结果均得到与二者目的 基因大小一致的片段。SDS-PAGE 电泳结果表明,被 Bacmid-AcPLAz和 Bacmid-AmPLAZ感染的Tn细胞抽提物均有特异性蛋白条带。薄层扫描定量分析 结果表明,二者的特异性蛋白(表达量)分别占 Tn细胞总蛋白的 5.32%和 5.35 %。用来源于意蜂蜂毒的AffiPLAZ(天然纯AffiPLAZ)作抗原免疫家兔,获得了 效价很高的多克隆抗体,以此多克隆抗体作为一抗进行 Western blot检测, ACPLA。和 AInPLAZ的表达产物均具有很强的免疫活性,在约 18 kD处与天然纯 AJTIPLAZ同样有明显的阳性条带,与预期目的蛋白分子量大小一致。用蛋黄③ 磷脂)作底物作生物活性测定,二者的表达产物均显示类似于天然纯AmPLA。 及意蜂蜂毒的PLAZ酶活活性。这是ACPLAZ和AmPLAZ基因在杆状病毒-昆虫细 胞表达系统中的首次成功表达。 通过PCR分别从pGEM-ACPLAZ和pGEM-AInPLAZ获得目的基因,经低熔 点凝胶回收纯化后,分别用平末端克隆策略插入pETBlueq载体,构建成大肠杆 菌表达载体 pET-AcPLAz和 pET-AmPLA。,并在 Tuner(DE3)plac菌株中进 行了诱导表达。二者的表达产物在SDS-PAGE中均呈特异性条带,薄层扫描定 量分析结果,H者的特异性条带蛋白(表达量)分别占菌体总蛋白的4.61%和 4.320。ACPLA。和 AinPLAZ基因的表达产物经wCStCffi bio0均具有很强的免 疫活性,在约15kD处均与天然纯AmPLA。同样有明显的阳性条带,与预期目的 蛋白分子量大小一致。这是A。PLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达,也是对 非人工合成的AZPLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达。 (二)中华蜜蜂和意大利蜜蜂峰毒透明质酸酶基因的克隆与表达 首先用RT干CR方法克隆成功中蜂蜂毒透明质酸酶(AcHya)基因和意蜂蜂 区!互 ) 浙江大学博士学位论文 中文摘要 毒透明质酸酶(AmHya)基因,测序结果,二者的核苦酸序列全长分别为门 64 hp 和* 49 hp,可分别编码 387个氨基酸残基和 384氨基酸残基的多肽,推测二个多 肽的分子量分别为 42.5 kD和 42刀 kD。对 7种生物的 Hya氨基酸序列联配结果, AcHya与 AJTIHyffi gi


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 沈立荣,张传溪,程家安;中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因的克隆与序列分析[J];农业生物技术学报;2002年01期
2 杜芝兰,张晓萍;中华蜜蜂工蜂上颚腺的超微结构[J];北京大学学报(自然科学版);1990年02期
3 杨冠煌;;数量下降迅速的物种 中华蜜蜂[J];科学世界;2007年06期
4 袁耀东;董炳义;杜芝兰;张宗炳;;中华蜜蜂囊幼病病毒的电镜观察[J];微生物学报;1983年03期
5 李江红,王敦,安世恒,刘艳荷,张传溪;中华蜜蜂磷酸甘油变位酶(Phosphoglycerate Mutase)基因的序列分析(英文)[J];Entomologia Sinica;2003年04期
6 平凡;;蜜蜂——世界不能少了它[J];民防苑;2006年01期
7 杨冠煌,王瑞武,杜芝兰;中华蜜蜂工蜂王浆腺活性的变化[J];昆虫学报;1991年02期
8 余林生,韩胜明;栖息环境和种间竞争对中华蜜蜂群体分布的影响[J];应用生态学报;2003年04期
9 杜芝兰;中华蜜蜂工蜂触角感受器的扫描电镜观察[J];昆虫学报;1989年02期
10 余林生,孟祥金,吴承武;中华蜜蜂交配和产卵行为生态学研究[J];应用生态学报;2003年11期
11 张小辉;朱忠珂;祁艳霞;;中华蜜蜂气味结合蛋白5,9,11,12基因克隆及生物信息学分析[J];黑龙江畜牧兽医;2010年07期
12 施婉君,张素方,张传溪,程家安;中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原蛋白cDNA的克隆与序列分析[J];昆虫学报;2003年02期
13 张爱静;张爱提;陈俊丽;黄珍粉;张小辉;;中华蜜蜂防御素基因克隆及生物信息学分析[J];特产研究;2011年02期
14 苏荣;;中华蜜蜂雄蜂飞行时间初探[J];福建农林大学学报(自然科学版);1992年03期
15 周冰峰;张富荣;王育敏;张田冬;;电取蜂毒对中华蜜蜂寿命的影响[J];中国蜂业;1993年02期
16 周婷,冯峰,董秉义;中华蜜蜂的欧洲幼虫腐臭病病原研究[J];昆虫学报;2000年S1期
17 杜芝兰,武剑西;中华蜜蜂工蜂下唇腺的电镜观察[J];北京大学学报(自然科学版);1990年04期
18 谢宪兵;孙亮先;黄康;曾志将;;中华蜜蜂急造王台的工蜂亲属优惠[J];动物学报;2008年04期
19 朱翔杰;周冰峰;徐新建;郑秀娟;王青;于瀛龙;巨骞;;福建中华蜜蜂种群形态数值分析[J];昆虫学报;2011年05期
20 杜芝兰,李宁;中华蜜蜂工蜂蜡腺细胞的超微结构[J];昆虫学报;1991年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨冠煌;孙庆海;韩盛明;;中华蜜蜂阿坝宗的调查和研究[A];北京昆虫学会成立四十周年学术讨论会论文摘要汇编[C];1990年
2 林桂莲;杨冠煌;吴黎明;;中华蜜蜂蛹期抗雅氏瓦螨机理研究初报[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
3 周冰峰;朱翔杰;;论中华蜜蜂种质资源的保护[A];中国养蜂学会中蜂协作委员会“2009年学术交流会”论文集[C];2009年
4 郑颖;范泉水;叶锋平;张志晓;李刚山;余方芳;李东江;;中国大虎头蜂蜂毒的部分性质与抗血清制备的研究[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
5 杨冠煌;林桂莲;;引发中华蜜蜂抗螨行为的信息途径研究[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
6 夏进标;李稳慧;钟文旗;;蜂毒致多脏器受损12例临床分析[A];第六届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2000年
7 匡海鸥;王介平;王瑞生;彭娟;匡邦郁;;中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius)的模式产地考察[A];中国养蜂学会生物学专业委员会2007年会论文集[C];2007年
8 李忠谱;李幸阳;;蜂毒膏药的制作与应用[A];中国自然资源学会全国第二届天然药物资源学术研讨会论文集[C];1997年
9 杨冠煌;;论引入西方蜜蜂Apis mellifera L.对中华蜜蜂Apis cerana cerana F.的危害及生态影响(简述)[A];当代昆虫学研究——中国昆虫学会成立60周年纪念大会暨学术讨论会论文集[C];2004年
10 杜武俊;谢蕙莲;;蜂毒抑制癌细胞与肿瘤之作用[A];海峡两岸第四届蜜蜂生物学研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 沈立荣;中华蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2和透明质酸酶基因的克隆与表达[D];浙江大学;2002年
2 李江红;中华蜜蜂(Apis cerana)毒腺cDNA文库的构建及主要毒蛋白基因表达调控研究[D];浙江大学;2005年
3 张素方;蜜蜂和胡蜂蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的克隆与表达[D];浙江大学;2003年
4 张莹;中华蜜蜂与意大利蜜蜂乙酰胆碱酯酶生物化学性质比较[D];福建农林大学;2005年
5 李红亮;中华蜜蜂头部ESTs文库构建和主要触角特异蛋白基因克隆、定位及其表达鉴定[D];浙江大学;2007年
6 李兆英;中华蜜蜂(Apis cerana cerana)脑部胚后发育和促性腺激素释放激素相关受体的表达研究[D];陕西师范大学;2007年
7 余林生;皖南中华蜜蜂种群数量动态及群体多样性研究[D];安徽农业大学;2007年
8 刘星;蜂毒抗肿瘤作用及其口服结肠定位释药系统的研究[D];沈阳药科大学;2002年
9 徐鹏;社会性昆虫抗菌肽基因的分子进化研究[D];浙江大学;2009年
10 施婉君;2种蜜蜂和4种胡蜂溶血肽基因克隆与表达研究[D];浙江大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄思思;皖南山区中华蜜蜂遗传多样性研究[D];安徽农业大学;2011年
2 叶兆云;蜂毒对膀胱恶性肿瘤细胞凋亡之影响的研究[D];南京中医药大学;2010年
3 刘亭亭;中华蜜蜂转录组测序及雌性蜜蜂基因表达分析[D];江西农业大学;2012年
4 张锦艳;中华蜜蜂(Apis cerana cerana)个体实验种群动态研究[D];福建农林大学;2010年
5 刘利;中华蜜蜂(Apis cerana cerana)LSD-1基因的克隆及其表达特性分析[D];山东农业大学;2011年
6 刘昭华;中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27.6的克隆、鉴定与功能分析[D];山东农业大学;2012年
7 孟飞;中华蜜蜂核糖体蛋白家族及MAPK信号途径相关基因的生物学特征分析[D];山东农业大学;2012年
8 巩志宏;中华蜜蜂(Apis cerana cerana)MsrA基因的克隆及其表达分析[D];山东农业大学;2011年
9 刘彩珍;中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius)中肠消化酶活性的探讨[D];福建农林大学;2001年
10 李秀;褪黑素与中华蜜蜂行为发育关系的初步研究[D];中国农业大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 孙君;桓仁建立中华蜜蜂保护区[N];本溪日报;2011年
2 付德明;蜂毒与艾滋病[N];中国医药报;2003年
3 周贻谋;帛书《养生方》与蜂毒疗法[N];中国中医药报;2006年
4 记者 沈洪;中华蜜蜂繁衍保护搭上标准快车[N];中国质量报;2010年
5 郭芳彬;德国研究用蜂毒对付艾滋病[N];中国医药报;2002年
6 唐瑞安;有关蜂毒治病的疑问[N];医药养生保健报;2006年
7 深圳商报记者 戴广军 通讯员 谢秋雄;小蜜蜂酿出大产业[N];深圳商报;2007年
8 福建省福州市肺科医院 陈意柯;我的蜂毒治病经验(一)[N];医药养生保健报;2007年
9 晓晖;蜂毒的现代药理研究与临床应用[N];中国医药报;2001年
10 李万瑶;蜂针疗法有哪些[N];中国中医药报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978