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螺旋藻种质与形态重建的分子遗传学研究

李晋楠  
【摘要】: 本论文利用RAPD分子标记及抗生素抗性标记分析了不同钝顶螺旋藻品系的遗传多态性,并与其形态学特征进行了比较,以期建立更合理的螺旋藻分类方法及加深对螺旋藻遗传背景的了解;同时,发现在养殖环境下变直藻丝体可以回变为正常螺旋形态的现象。在比较了正常藻丝体、变直藻丝体及回复正常螺旋形态的藻丝体一组材料生物学特性的基础上,进一步在蛋白质及DNA水平上找到了转座子调控此形态变异的某些证据,为阐明螺旋藻形态变异与重建的分子遗传学机制以及解决螺旋藻大规模生产的实际问题提供理论依据。研究主要结果如下: 1 螺旋藻种质形态及RAPD分子标记的研究 对Sp-D、Sp-Z、Sp-S、Sp-B、Sp-C、Sp-F1和Sp-F2等7株钝顶螺旋藻材料的藻丝体及细胞的形态学特征进行了统计分析。结果表明,它们的形态具有一定差异。 以含水量约为10%的冷冻藻泥为材料,采用CTAB缓冲液及二次沉淀提取法,建立了一个可获得较高纯度和得率、适用于RAPD分析的螺旋藻基因组DNA制备方法。在此基础上,采用优化后的提取方法制备Sp-D等7株钝顶螺旋藻的基因组DNA,利用106条随机引物对其进行RAPD扩增,从中筛选出23条多态性引物,其扩增出的总条带数为151,多态性条带数为120。用Nei’s公式与欧氏距离类平均法对此扩增结果进行聚类与亲缘关系分析。结果表明,RAPD分类结果与7株材料的某些生理生化和分子生物学特性相吻合。因此,RAPD分子标记可以在分子遗传学水平上作螺旋藻分类的重要依据,结合螺旋藻的形态特征,建立更科学合理的分类方法。 2 螺旋藻抗性标记的研究 采用Sp-D、Sp-J、Sp-Z、Sp-S、Sp-B、Sp-C、Sp-F1等7个正常螺旋形的钝顶螺旋藻藻株、一个辐射诱发藻丝超长的突变体藻株Sp-Z(SL)及2个由螺旋形变为直线形的藻株Sp-D(L)与Sp-J(L),就其对氯霉素、青霉素、卡那霉素、洁霉素及链霉素等5种抗生素标记的抗性进行了分析与比较,结果表明:(1)10株钝顶螺旋藻对 卡那霉素、氯霉素及链霉素的抗性表现较为一致。对卡那霉素的抗性均为极强;对 链霉素的抗性较小,IC;。为 56.476刀 P g/ml;对氯霉素的抗性最小,IC。为 13* ZI.5 V旮。O)10株钝顶螺旋藻对青霉素和洁霉素的抗性,因螺旋藻藻株的不同 有较大差异。其中即上和SpS对青霉素的抗性较强;Spc其次:SP*、Sp- mQ、sp刁8Q的生长虽受到青霉素的明显抑制,但未能完全致死:sp-J、8卜 J0X SpB、SpF可被全部致死,因此它们对青霉素的敏感性最强,抗性最小。 同时,SpD、SP*、SpZ和即-C 4个藻株对洁霉素抗性较强,而其余 6个藻株则 对洁霉素的作用较为敏感。*) Sp0、SpJ及即上 3株正常形态的钝顶螺旋藻品系 与其形态变异(或突变)藻丝体Sp*队XSP*O)及SpZ(SL对洁霉素的抗性存在差 异,该差异可能与其形态变异有关。 3养凹环墟下变直问雄羹回复正常形态的发现及形态变异相关蛋白的研究 首次发现在养殖环境下钝顶螺旋藻即-M藻株的变直藻丝体Sp-M几)可以回变 为正常螺旋形态藻丝体SpM卜m,且生长速率和细胞组成等可几乎完全回变。采 用含SDS的缓冲液提取蛋白,以20o、30o、40o及80%(vlv丙团分级沉淀,对 Sp-M、SP-M几)和回变藻丝体Sp-Mo-H)不同蛋白级分进行梯度凝胶电泳分析。结 果发现,3种材料以20%、30%、40%丙酮沉淀的蛋白级分电泳图谱均相同;在 80地州丙酮沉淀的蛋白级分中,s卜M与即-M卜m两种螺旋形藻丝体都存在分子 量为 53.7 kD的一条蛋白带,而直线形藻丝体即-MO则缺失此带,表明此53.7 l 蛋白与螺旋藻的形态变异相关。 4舱于调拄问旋葵形态重羹的分子遗 究 根据螺旋藻中己知的转座子分别设计合成上游及下游各一组半套式引物,通过 对半套式引物有效性、随机引物和半套式引物的退火温度与反应浓度以及有效半套 式引物组合与随机引物的筛选试验,建立了可特异性扩增转座子在基因组上位点旁 侧序列的 neven PCR分析技术。 用筛选出的有效的随机引物853与半套式引物组合PU.2/Pn.3oU4、889与Pd !”小2爪d4 E对,从8卜M的基因组DN A中分别扩增出了已知转座子的上游和下 游目的片段O-M心和 SpM吻。测序结果表明,SpM山为 sl3 hp,其中 306 hp与 转座子的 5’端重合;SP-Md为 58!hp,其中 88 hp与转座子的 3’端重合。根据 jspM七及Sp-M*中的转座子外侧碱基顺序设计一对可向内扩增的引物,以Sp-M 的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其产物的测序结果表明,其中正好包含已知 转座子及即-*0和即-**中引物内侧的序列,从而进一步证实sp-*叱和即-** 即为转座子在基因组上存在位点的上游及下游旁侧序


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