水稻DH群体的构建与微卫星标记分析

【摘要】： 微卫星指以几个核苷酸(多数为2-4个)为重复单位的串联DNA序列，也称之为简单序列重复(SSRs)。由于它能产生丰富的多态性，已成为应用广泛的遗传标记之一。为了解外源基因在杂交转育后代群体中的遗传与表达规律，本研究构建了适于水稻SSRs标记作图的DH群体和F_2群体，利用145个SSRs标记对群体多态性进行检测，分析了不同群体中SSRs标记的分离情况，并对第6染色体waxy基因附近区域进行了作图，为利用SSRs标记进行遗传作图与基因定位研究打下基础。主要研究结果如下： 1、S-3307对水稻花药培养愈伤组织诱导、分化和壮苗的效应 S-3307(烯效唑)是80年代初推出的一种植物生长延缓剂和广谱内吸性杀菌剂。在水稻花药培养愈伤组织诱导和分化培养基中添加S-3307，对愈伤组织的诱导率、绿苗分化率的影响均达到显著水平。在诱导培养基中，低浓度(≤1mg/L)的S-3307可以导致愈伤组织诱导率和绿苗分化率的提高，高浓度的S-3307(≥10mg/L)却导致花药发黄死亡。在分化培养基中添加低浓度(≤1mg/L)S-3307，可使绿苗分化率成倍提高，当S-3307的浓度为1mg/L时，绿苗分化率达到最大值，同时白苗分化率显著降低，出现了部分黄绿苗；添加高浓度的S-3307对愈伤组织的分化有抑制作用，当浓度达到25mg/L时，愈伤组织褐化死亡；S-3307对不同品种的作用效应不同，表现出基因型间的差异。在壮苗培养基中添加0.1-1mg/L的S-3307，可以明显改善花粉植株的生长状态，控制苗高，促进根系发育，起到壮苗作用，提高移栽成活率。 2、直接产生抗除草剂转基因水稻纯合体的新方法 提出在花药培养过程中添加抗性筛选物质(如除草剂Basta的有效成分PPT)，直接筛选出含有目的基因的纯合体，以提高转基因杂交后代育种选择效率的新途径。以转bar基因水稻植株和非转基因植株杂交F_1为试材进行花药培养，并对分化的绿苗进行PCR检测和田间抗性检测，结果表明，在愈伤组织诱导培养基和分化培养基中分别添加0.05mg/LPPT以及未添加PPT的对照，均产生较多的愈伤组织和绿苗，并有较高比例不抗除草剂的假阳性株。当PPT浓度增至0.1mg/L时，所得花培苗全部抗除草剂，即为阳性株，显示很好的筛选作用。随着PPT浓度继续增加，愈伤组织诱导率和绿苗分化率急剧下降。而当PPT的浓度增至5mg/L时，愈伤组织的诱导和幼苗分化完全被抑制。对30个加倍单倍体系作连续两代农艺性状考察，约73％以上的株系在遗传率较高的性状 中，变异系数很小（＜10％），说明这些株系的基因型已经纯合。 3、bar基因和P＊基因在DH群体中的抗性及遗传 对含有外源基因（构建于同一质粒载体上的bar基因和历 基因）稳定遗传材料 HH35与非转基因材料UX58杂交FI进行花药培养，得到84个加倍双单倍体DH＼对其 进行连续两世代遗传分析和大田抗性检测表明：转基因后代中bar和PinH基因紧密连锁 并稳定遗传：外源bar基因的导入增加了植株对除草剂Basta的抗性，但不同植株抗性 表达程度存在差异，少数株系表现为基因沉默：外源乃加厂基因可以增加植株对螟虫的 抗性，为筛选高抗螟虫的花培系提供了可能：并且外源基因的导入，对植株农艺性状的 影响不大。 4、SSRs标记水稻不同作图群体中的分离 用145对SSR引物对3个F。群体（CWZ、。W3、CW103）和容量为84个株系的 DH群体进行了多态性分析，其中40％以上标记在各群体中显示多态性。进一步研究 7个多态性标记在各群体的分离方式，表明不同群体SSRS标记的分离有明显差异， 其中cW3、cW103和DH群体中各标记分离基本正常，而cWZ群体存在严重的偏分离， 不适合于连锁作图和基因定位。应用FZ群体CW3和DH群体对第6染色体Zmp基因 附近的5个SSRS标记作图，分别得到覆盖sl了。M和57．gCM的连锁群。对这两个连 锁群进行比较分析表明，利用不同作图群体获得的连锁图谱具有较好的通用性。