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胶原——壳聚糖多孔膜的生物相容性研究

胡学庆  
【摘要】: 背景资料 皮肤的烧伤,创伤和慢性溃疡等皮肤病变常常导致局部或大面积的皮肤全层缺损。皮肤创面的修复和愈合是外科领域的基本问题。组织工程化皮肤的出现为大面积烧伤治疗以及皮肤慢性创面和疤痕防治提供了新的解决途径。1980年Yannas和Burke提出了人工皮肤的设计原则,真皮替代物的选择是其中一个重要方面。真皮支架必须具有良好的细胞相容性和组织相容性,在移植创面后应能被机体逐渐降解吸收,并适合受体真皮组织的重建。国外多以胶原一氨基葡聚糖制作人工真皮支架,形成了Integra等产品,但是价格十分昂贵。开发一种价格低廉,又能够满足生物学和临床要求的真皮支架产品十分重要。胶原和壳聚糖在自然界分布广泛,制取相对容易,所需成本不高,两者共混后使材料具有一定的机械强度。我们采用胶原和壳聚糖制成的多孔膜作为真皮支架来研制组织工程化皮肤,对胶原一壳聚糖多孔膜进行生物相容性研究和降解研究十分必要,这也是组织工程化产品安全性评价和标准化的需要。 目的 研究胶原—壳聚糖多孔膜的细胞相容性和组织相容性,考察胶原—壳 浙江大学硕士学位论文 聚糖多孔膜在体内的降解情况,评价胶原一壳聚糖多孔膜作为人工真皮支 架的可能性和安全性,为进一步研制人工皮肤打下基础。 材料和方法 一、胶原一壳聚糖多孔膜的制作: 以牛健为原料制取二型胶原。取粗制甲壳素精制后与NaOH与反应, 提纯获得壳聚糖。以胶原与10%壳聚糖共混,经冻干成膜,以0卫5%戊二 醛交联。同时制备未经交联的和干热交联的胶原一壳聚糖多孔膜。 二、胶原一壳聚糖的细胞相容性研究: 1.真皮成纤维细胞的分离培养: 取包皮环切术后的幼儿包皮酶消化法分离培养真皮成纤维细胞并传 代,以3-4代细胞作为工作细胞。 2.真皮成纤维细胞在胶原一壳聚糖多孔膜上的培养: 将培养的真皮成纤维细胞浓度调整到 5 X 10’冰。将细胞悬液接种于 戊二醛交联的胶原一壳聚糖多孔膜,加 DMEM+10%小牛血清培养基后放 置 37’C,5%CO。孵箱内浸没培养,每天更换培养基。 3.细胞一多孔膜复合物的组织学观察: 取培养7天的细胞一多孔膜复合物制成石蜡切片,HE染色,光学显微 镜下观察并照相。 4.细胞一多孔膜复合物的激光共聚焦显微镜观察: 取培养 7天的细胞一多孔膜复合物,以 10ug/Inl的荧光染料 CFAD- AM100UL染色,檄光共聚焦显微镜检测激光激发的绿色荧光,扫描成像 观察活细胞生长倩况。 二 浙江大学硕士学位论文 三、胶原一壳聚糖多孔膜的组织相容性研究: 1.胶原一壳聚糖多孔膜的动物皮下埋植实验: 以健康家兔12只作为实验动物,随机分成4组,每组3只。将:A、 未交联型;B、干热交联型;C、戊二醛交联型三种胶原一壳聚糖多孔膜于 各组内交叉埋植入兔耳背皮下,每个兔耳背埋植2处,即每种多孔膜于各 组内分别埋植4处。手术后家兔分笼饲养,每天观察并记录全身情况及手 术区变化。 2.组织学观察: 手术后分别于3、7、14、28天任选1组(3只)家兔,切取包括植入 多孔膜在内的全层兔耳组织,常规切片,HE染色,显微镜下观察组织改变 并照相记录。 四、胶原一壳聚糖多孔膜的生物降解研究: 将戊二醛交联型胶原一壳聚糖多孔膜兔耳背埋植28天组织块制成石 蜡切片,免疫组化检测牛1型胶原在组织内的残留情况。显微镜下观察戊 二醛交联型多孔膜兔耳背埋植28天后牛二型胶原在组织中的残留情况来表 征多孔膜在体内的降解倩况。 结 果 一、真皮成纤维细胞——多孔膜复合物的组织学观察 胶原一壳聚糖多孔膜在光镜下呈现红染的多孔结构,网孔分布均匀。 培养7天时真皮成纤维细胞主要集中在多孔膜的表面,靠近多孔膜表面的 网孔内也有细胞长入,但数量不多,细胞沿网孔生长,形态不规则。 3 浙江大学硕土学位论文 二、真皮成纤维细胞一多孔膜复合物激光共聚焦显微镜观察 培养7天的细胞一多孔膜复合物可见到成活的真皮成纤维细胞呈绿色 荧光于多孔膜表面密集生长,形态呈梭形或不


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