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MMP-13及VEGF在酒精性肝纤维化中的表达

竺国芳  
【摘要】: 目的与背景 近年来全球性的酒精消费量呈上升趋势,酒精性肝病的发病亦显著增加,成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。长期大量饮酒可引起酒精性肝病,包括脂肪肝,酒精性肝炎,肝纤维化及肝硬化等。在美国,嗜酒者中约10—35%可发展为酒精性肝炎,10—20%发展致肝硬化,每年死于肝硬化的人中约10,000-20,000是由于饮酒引起的。 肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的病理过程,是肝内细胞之间及其细胞外基质(ECE)相互作用的结果,最终导致ECM在肝内的过度沉积。胶原Ⅰ、Ⅲ是ECM沉积的主要成分,主要由MMP—1,MMP—8,MMP—13降解,而其它MMPs如MMP-9或MMP—3则不能。ECM的这种过度沉积不仅是由于ECM合成增多,更大程度上是由于降解减少引起。目前研究表明MMP-13在CCl_4所致的大鼠肝纤维化初始阶段短暂地上升明显,但在肝纤维化发展阶段表达微弱,而MMP-13的这种短暂变化尚未在酒精性肝病中有所报道。血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞的一种特异性丝裂原,它与各种肝病的关系 浙江大学硕士研究生学位论文 也越来越受到关注。在蛋白及分子水平各类肝病中VEGF的作用己被广泛研 究,己证实yEGF在肝窦内皮细胞的生长,肝细胞再生以及原发性、继发性 的肝癌发生发展,各种良性肝病如血管瘤、肝炎等中起重要作用,但至今 VEGF在酒精性肝病中的研究尚不多,且对其在其中所起的作用了解甚少。 本文通过用 RT-PCR检测 WP-13 mRNA及 VEGF mRNA在酒精性肝病的表 达水平,探讨它们在酒精性肝病发病机制中的作用。 0 材料与 方法 采用健康,性成熟,一级质量标准的S{大鼠34只,雌雄各半,体重 180-Z10g,分笼喂养。大鼠由浙江大学医学院动物中心提供。随机分为2组, 灌酒组24只,正常对照组10只均为雌雄各半。白酒灌胃组以56度的白酒 平均以7g/kg的剂量每日早晨灌胃一次,正常对照组则以等量生理盐水灌 注。各组大鼠实验期间均予以饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。分别在4 周,门周及 24周采用股静脉放血法处死实验组大鼠取肝脏标本,部分浸泡 于 10%福尔马林中留于病理检查,部分置于液氮中,再放于.80 t冰箱保存 留于 RT-PCR。 大鼠肝脏组织Masson三色染色观察,按 Jimenez提出的 SSS计分来判 定大鼠肝纤维化程度:取黄豆大小肝脏组织用TriZ。1抽提总RNA,并按 GIBCOBRL公司MMLV逆转录酶试剂盒说明书进行逆转录成CDNA,20 ℃保存:取逆转录产物2川为模板,加入相应的引物进厅叮R扩增。*M卜13 引物:正义:5’.TGA CTA TGC GTG GCT GGA A.3‘,反义:5’.AAG CTG AAA TCT TGC CTT GGA-3‘,扩增片段为 355b。VEGF引物:正义:5’ -TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA-3‘,反义:5’-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T-3‘,扩增片段为 568hp。GAPDH为内参照,正义:5’ 3 浙江大学硕士研究生学位论文 -CAT GGT CTA CAT GTT CCA GT-3‘,反义:5’.GGC TAA GCA GTT GGT GGT GC-3‘,扩增片段为 349hp。以上引物均由上海生工生物工程有限公 司合成。取 Zul模板,0.ZulTeq酶,正反引物各ml,10mM dNTPO.sul,25mM Mgcl。1.Zul(终浓度为1.smM)及10XbufferZul,加水至终体积20ul。MMP-13 首先94C2分钟变性,以后94C20秒一52’C45秒(GAPDH退火温度为61 oC)一72℃45秒,共 28个循环,72t7分钟终止反应。VEGF首先 94℃5 分钟变性,以后 94℃45秒一66℃45秒(GAPDH退火温度为 61 oC)-72℃ 45秒,共 30个循环,72C5分钟终止反应。MMP-门取汕 PCR产物经 2% 琼脂糖凝胶(含0.SUg/ml$化己锭)电泳,所得目标条带用紫外快速成像 仪拍照,测得其光密度值,然后以与相应的GAPDH表达量的比值作为目 的基因的表达的相对数值;VEGF取 sul PCR产物经 2%琼脂糖 凝胶(含 0.sug/ml$化己锭)电泳,计所得目标条带数,与各组总数相比 求得其阳性率。 7.统计学处理:所有数据用SPSS10刀统计软件进行在检验、Kendall相


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