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壳寡糖对巨噬细胞IL-1β、TNF-α基因表达的影响

张小边  
【摘要】: 几丁质又称甲壳素,是自然界最丰富的生物资源之一,具有多种生理功能。几丁质部分脱乙酰化产物是壳聚糖。为了改善几丁质、壳聚糖不溶于水的缺陷,将其降解为几丁寡糖、壳寡糖后具有较好的水溶性,易于分散吸收。众多学者研究发现几丁质、壳聚糖及几丁寡糖、壳寡糖具有免疫调节作用。将这些多糖、寡糖经腹腔或静脉给予小鼠,可以使其腹腔渗出液及外周血中多型核白细胞增多,巨噬细胞、脾脏T淋巴细胞、NK细胞等活性增强。各种免疫功能细胞激活后,分泌各种免疫活性分子,如白细胞介素、肿瘤坏死因子及干扰素等。通过这些分子介导,免疫功能细胞互相调节,自身的免疫活性也加强,巨噬细胞释放过氧化氢、一氧化氮等活性物质,T细胞、NK细胞的细胞毒活性增高,整体免疫系统功能增强。几丁质及其衍生物通过调节机体免疫系统功能,能增强机体对多种病原微生物的抵抗作用,对实验性小鼠Meth A纤维肉瘤、S180肿瘤、MM44实体瘤及Lewis肺癌等肿瘤细胞有抑制效应。 研究表明壳寡糖具有免疫调节作用,有抗感染及抗肿瘤活性。但众多研究以动物整体实验为主,关于壳寡糖对免疫系统某一特定环节直接作用的研究较少。为了探索壳寡糖对免疫系统调节作用的机理,本课题以小鼠巨噬细 浙江大学顾士学位论文 胞作为研究对象,通过体外实验将壳寡糖作用于巨噬细胞,运用相对定量逆 转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术,检 测对巨噬细胞细胞因子 ILIp、TNF a基因转录和翻译水平的影响。 提取小鼠腹腔巨噬细胞并培养使贴壁生长后,巨噬细胞实验组中加入含 一定浓度壳寡糖的培养液,巨噬细胞对照组则只加培养液,继续培养24小时。 收集实验组和对照组上清培养液留待ELISA实验用,巨噬细胞通过异硫氰酸 腑-酚-氯仿一步法提取总RNA。 由于“管家基因”p-actin表达稳定,其表达量比细胞因子基因高,所 以相对定量队-PCR实验中,p-actin cDNA的KR引物量设为两种细胞因子 基因叨NA引物量的一半,确保p-actin和细胞因子产物量比较均匀。另外, 对三种基因。DNA进行PCR扩增动力学分析后,扩增循环数确定为30,此时 三种。DNA都处于指数扩增期,确保可以用p-actin扩增产物量作为细胞因 子PCR产物量的参比标准,从而可以对细胞因子基因转录水平进行比较。 为了明确壳寡糖对巨噬细胞作用的最适浓度,首先通过RT-PCR确定作用 最适浓度范围为 5~50 u g加1。在此范围内进一步实验发现 20~40 n giM的 壳寡糖能增强巨噬细胞IL-16和TNF-口基因转录,效应有剂量依赖性。选定 20 u g/ml浓度的壳寡糖继续作用于巨噬细胞,BT-PCR结果表明可以明显提高 两种细胞因子基因转录水平,实验组IL-二p和TNF-口基因转录量为对照组的 l.9倍左右…<0.of):ELISA实验显示,两种细胞因子分泌也显著增多,实 验组 ILIp和 TNF-口量分别为对照组的 2.4倍和 2倍左右巾<0 01),说明 壳寡糖能促进巨噬细胞两种细胞因子基因翻译成蛋白质。 本实验表明,壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL叶p及TNF-a的基因表 达,使两种细胞因子基因转录及刁译水平增高。


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