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鼻咽癌患者血浆游离EB病毒DNA定量分析及其临床意义

袁晖  
【摘要】: Epstein-Bart(EB)病毒感染与鼻咽癌发生之间的关系一直受到关注,事实上,几乎所有的未分化鼻咽癌组织中均能检测到EB病毒DNA,而且鼻咽癌组织中的EB病毒-DNA是呈克隆性的,即来自于单个的病毒感染细胞,提示病毒在促进恶性转化的过程中发挥了作用。EB病毒甚至能诱发裸鼠移植入胚鼻咽粘膜上皮细胞癌变。 鼻咽癌病人血清中含有高滴度的EB病毒相关抗原的抗体,除病毒壳抗原-抗体(Viral capsid antigen-immunoglobin A,VCA-IgA)外,还有多种EB病毒相关抗原的抗体,例如EB病毒的核抗原(EBNA)-抗体。VCA-IgA在我国常用作鼻咽癌的筛选检查,但是VCA-IgA滴度水平未显示与鼻咽癌分期相关,其滴度变化与临床病程和治疗效果也无关。因此,VCA-IgA可用于指示发生鼻咽癌的危险度,而不能用来监测鼻咽癌进展。 某些恶性肿瘤患者外周血存在肿瘤来源的DNA是近五年的研究发现。从此开辟了非侵入性监测肿瘤进展的新途径。Lo等首先采用荧光定量 (eorescence eAnive,FQ)-PCR技术,在 96%鼻咽癌患者血浆中测得 不同水平的EB病毒、DNA拷贝。从此,建立了实时定量测定鼻咽癌患者血 浆中肿瘤相关的EB病毒-DNA的精确系统。 本文应用下QPCR技术测定鼻咽癌患者治疗前、后血浆中游离EB病 毒-DNA拷贝,同时应用非同位素原位杂交技术检测鼻咽癌原发组织中EB 病毒编码的 RNA-l(EB hCoded RNA-l,EBERI),分析血浆中游离 EB病 毒DNA的来源,探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。 一材料和方祛 1 实验材料 收集2(Xk年5月-2001年5月在浙江大学医学院附属二院耳鼻咽喉科 和肿瘤放疗科诊治、病理诊断明确的55例鼻咽癌患者的外周血,包括治疗 前血样 42例,治疗后(放疗或加化疗)血样 24例。其中 11例收集到自身 对照的治疗前、后双份血样。另收集30例健康助血员血样作为正常对照。 均取外周血SInl于EDTA抗凝试管,静置片刻离心,取血浆15llil,-20C 保存。上述鼻咽癌患者的石蜡包埋活检组织标本选近期16例用于原位杂交 实验。 鼻咽癌55例中,男4O例,女15例,年龄19-75岁,中位年龄530岁。 经鼻内窥镜检查和鼻咽部CT扫描,按照UICC/AJCC(1997)分期标准, I期 5例,11期 25例,ill期 10例,W期 15例。3O例腔康助血员中,男 22例,女8例,年龄34-50岁,平均430岁。 二 实验方法 血浆EB病毒.DNA定量PCR测定: 取外周血浆 15nd,4’CX 12mpm离心 10分钟,取沉淀,加 DNA 2 提取液(含OS%SDS、100Vg/ml蛋白酶 K),煮拂、冰浴各 10分钟,4C Xlpom离心5分钟,取上清液ZPI,用美国PE公司SeqUneeDetector 777行 PCR定量扩增。引物序列为 5’-TCTCTGCCTCCAGGCAAG-3’和 5’-AGAGGGCCTGTCCACCGT.3’,双标记荧光探针的序列为 5’-(FAM) CTGTCTGTAAAGTCCAACTCC-(TAMRA)-3’。扩增程序为①93℃X 2 分钟预变性;匡D3℃X45秒一55℃x 120秒,狈个循环;③33℃x3分钟 延伸。荧光检测波长为 slsnm。阳性对照为 10‘、104、102拷贝/ul的阳性 模板,阴性对照为空白PCR反应液。 非同位素原位杂交 EBER检测 约 in g合成 EBERI模板加入 DEPC灭菌蒸馏水至 16 yi,沸水浴 10 分钟后立即置人冰盒,加入 DigPrime标记液 4 nl,置入 37℃水浴 4小时, 加 02M EDTA(PH 80)4V,终止反应,20’C冰箱保存。 石蜡标本 5 u m行连续切片,每例切取 3片,分别作常规 HE染色、原 位杂交和阴性对照试验。 切片二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,稀酸(02N盐酸)处理15分钟, 蛋白酶K消化15分钟,加预杂交液后置于湿盒中30分钟,配制含地高辛 标记探针的杂交液,66oC变性10分钟滴加于湿盒内的切片中,42t杂交过 夜。阴性对照组则直接滴加不含探针的杂交液。 次日,切片用 2 X SSC和 IX SSC浸泡 2次后,先滴加 Bu囚盯 1稀释的 Titon-XIOO和 NSS,尔后滴加 Btlner稀释的偶联碱性蛋白酶的抗地高辛 抗体,再用Bill:I7erl和BI.-------r ill浸泡?


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