鼻咽癌患者血浆游离EB病毒DNA定量分析及其临床意义

【摘要】： Epstein-Bart(EB)病毒感染与鼻咽癌发生之间的关系一直受到关注，事实上，几乎所有的未分化鼻咽癌组织中均能检测到EB病毒DNA，而且鼻咽癌组织中的EB病毒-DNA是呈克隆性的，即来自于单个的病毒感染细胞，提示病毒在促进恶性转化的过程中发挥了作用。EB病毒甚至能诱发裸鼠移植入胚鼻咽粘膜上皮细胞癌变。 鼻咽癌病人血清中含有高滴度的EB病毒相关抗原的抗体，除病毒壳抗原-抗体(Viral capsid antigen-immunoglobin A，VCA-IgA)外，还有多种EB病毒相关抗原的抗体，例如EB病毒的核抗原(EBNA)-抗体。VCA-IgA在我国常用作鼻咽癌的筛选检查，但是VCA-IgA滴度水平未显示与鼻咽癌分期相关，其滴度变化与临床病程和治疗效果也无关。因此，VCA-IgA可用于指示发生鼻咽癌的危险度，而不能用来监测鼻咽癌进展。 某些恶性肿瘤患者外周血存在肿瘤来源的DNA是近五年的研究发现。从此开辟了非侵入性监测肿瘤进展的新途径。Lo等首先采用荧光定量 （eorescence eAnive，FQ）－PCR技术，在 96％鼻咽癌患者血浆中测得 不同水平的EB病毒、DNA拷贝。从此，建立了实时定量测定鼻咽癌患者血 浆中肿瘤相关的EB病毒－DNA的精确系统。 本文应用下QPCR技术测定鼻咽癌患者治疗前、后血浆中游离EB病 毒－DNA拷贝，同时应用非同位素原位杂交技术检测鼻咽癌原发组织中EB 病毒编码的 RNA－l（EB hCoded RNA－l，EBERI），分析血浆中游离 EB病 毒DNA的来源，探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。 一材料和方祛 1 实验材料 收集2（Xk年5月－2001年5月在浙江大学医学院附属二院耳鼻咽喉科 和肿瘤放疗科诊治、病理诊断明确的55例鼻咽癌患者的外周血，包括治疗 前血样 42例，治疗后（放疗或加化疗）血样 24例。其中 11例收集到自身 对照的治疗前、后双份血样。另收集30例健康助血员血样作为正常对照。 均取外周血SInl于EDTA抗凝试管，静置片刻离心，取血浆15llil，－20C 保存。上述鼻咽癌患者的石蜡包埋活检组织标本选近期16例用于原位杂交 实验。 鼻咽癌55例中，男4O例，女15例，年龄19－75岁，中位年龄530岁。 经鼻内窥镜检查和鼻咽部CT扫描，按照UICC／AJCC（1997）分期标准， I期 5例，11期 25例，ill期 10例，W期 15例。3O例腔康助血员中，男 22例，女8例，年龄34－50岁，平均430岁。 二 实验方法 血浆EB病毒．DNA定量PCR测定： 取外周血浆 15nd，4’CX 12mpm离心 10分钟，取沉淀，加 DNA 2 提取液（含OS％SDS、100Vg／ml蛋白酶 K），煮拂、冰浴各 10分钟，4C Xlpom离心5分钟，取上清液ZPI，用美国PE公司SeqUneeDetector 777行 PCR定量扩增。引物序列为 5’－TCTCTGCCTCCAGGCAAG－3’和 5’－AGAGGGCCTGTCCACCGT．3’，双标记荧光探针的序列为 5’－（FAM） CTGTCTGTAAAGTCCAACTCC－（TAMRA）－3’。扩增程序为①93℃X 2 分钟预变性；匡D3℃X45秒一55℃x 120秒，狈个循环；③33℃x3分钟 延伸。荧光检测波长为 slsnm。阳性对照为 10‘、104、102拷贝／ul的阳性 模板，阴性对照为空白PCR反应液。 非同位素原位杂交 EBER检测 约 in g合成 EBERI模板加入 DEPC灭菌蒸馏水至 16 yi，沸水浴 10 分钟后立即置人冰盒，加入 DigPrime标记液 4 nl，置入 37℃水浴 4小时， 加 02M EDTA（PH 80）4V，终止反应，20’C冰箱保存。 石蜡标本 5 u m行连续切片，每例切取 3片，分别作常规 HE染色、原 位杂交和阴性对照试验。 切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，稀酸（02N盐酸）处理15分钟， 蛋白酶K消化15分钟，加预杂交液后置于湿盒中30分钟，配制含地高辛 标记探针的杂交液，66oC变性10分钟滴加于湿盒内的切片中，42t杂交过 夜。阴性对照组则直接滴加不含探针的杂交液。 次日，切片用 2 X SSC和 IX SSC浸泡 2次后，先滴加 Bu囚盯 1稀释的 Titon－XIOO和 NSS，尔后滴加 Btlner稀释的偶联碱性蛋白酶的抗地高辛 抗体，再用Bill：I7erl和BI．－－－－－－－r ill浸泡?