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肾缺血再灌注损伤内皮素与细胞凋亡研究及氨基酸的保护作用

童炎岳  
【摘要】: 在泌尿外科领域一些复杂的,肾脏手术,如肾实质切开取石术,肾肿瘤的肾部分切除术(Nepbon sparing Nephrectomy),暂时阻断血流是必要的。如何减轻和预防肾脏缺血再灌注损伤,一直是人们对肾脏损伤保护研究的主要课题。肾缺血再灌注损伤的病理机理非常复杂,研究资料表明,内皮素-1(ET-1)和细胞凋亡参与了病理生理过程。据报道,氨基酸对肾缺氧损伤有保护作用,其机理主要与稳定生物膜结构,保护线粒体有关。本研究主要通过检测大鼠肾缺血再灌注后尿生化、血肾功能,肾组织中ET—1水平和肾脏细胞凋亡情况,探讨8种L一支链氨基酸(甘、丙氨酸等)合剂对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨可能的机理。 材料和方法 一、实验对象:健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只,体重240±20g。 二、实验方法: 1.氨基酸合剂配制:称取适量甘氨酸、丙氨酸等8种支链氨基酸,溶解后,高压灭菌后备用。 2.动物实验: 回 浙江大学硕士学位论文-中文摘要 门)动物分组:60只 SPrague-Dawley大鼠随机分为 A组(假手术组, n—8),B组(对照组,n=26),C组(治疗组,n=26); Q)麻醉:2%戊巴比妥钠 60mg/kg腹腔注射麻醉; 门)动物模型:左股静脉插管,接微泵持续输注生理盐水(A、B组) 或氨基酸合剂u组人速度 lml八。膀肮造瘦,接预先称重的 1.sml 微量离心管,收集尿标本。输注60分钟后,行腹部正中切口,无损伤动脉 夹阻断双侧肾蒂45分钟。假手术组不上夹。于再灌注3小时留取尿标本和 断尾取血0.sml,再灌注24 ’J’时,取门静脉血3ml。根据分组要求在缺血 45分钟,再灌注 15分钟、3小时、24小时处死大鼠,切取左侧肾脏。 3.检验: 门)血标本:测定肌配、尿素氮浓度; (2)尿标本:测定肌酥,钠钾浓度,计算出3小时内生肌配清除率; 门丫肾组织 ET上测定:称取肾皮质 100mg,尽快放入 0.lmol/LHAC ml, 略做碾磨,然后在 100 C水浴中煮沸 10分钟,再次碾磨制成匀浆。4 oC 3000rpm,离心 15min,取上清一20oC以下保存。然后做ETq放免测定, 按放兔药盒说明书操作。 (4)肾脏细胞凋亡、坏死测定:先制作单细胞悬液。然后做细胞调亡、 坏死Amexim狈定,按照 Apoalert TM imexinV Apoptosis Kits说明书操 作和流式细胞仪检测。 三、统计学处理: 数据以平均数士标准差(了士S)表示。采用SAS统计软件对数据进 行方差分析。 2 D 浙江大学硕士学位论文.中文摘要 结 果 一、再灌注 3小时和 24小时血肌酥、尿素氮浓度变化。 再灌注 3 ’J’时,氨基酸合剂治疗组血肌酚N5士8 u mol几L尿素氮 (l.83士2.52mmol/L)低于对照组(7士4 n mol/L,25.45土5.10mmol几), 差异有显著性(P<0刀1)。至24小时氨基酸合剂治疗组血尿素氮门6刀6土 3二 lmmol/L)低于对照组(24l 8土 4.97mmol几,P<0刀 1)。 二、再灌注3小时尿肌酌的排泄和内生肌研清除率变化。 氨基酸合剂治疗组尿肌酥排出量o0.98a.33 nxnol/L·min)高于对照组 *.7812.24 nmol/L·min),差异有显著性0功刀 1人再灌注 3 ’J’时治疗组 的内生肌酌清除率(699.33土77.7ul/min)高于对照组(19刀3士36.30ul/min) 差异有显著性(P<0刀1)。 三、尿钠、尿钾浓度变化。 再灌注3小时治疗组尿钠浓度* 几和尿钾浓度*3厂tZ.三 mmol/LV于对照组(尿钠 164t24mmol/L,尿钾 87.8t4.4nunol几X 差异有显 著性(P<0刀1)。 四、肾组织ET-l的变化 对照组在缺血 45分钟,再灌注 15分钟和 3小时组肾组织内 ET.l分别 是 7.34士 2.50、10*7士 2.76、门*0士 2.69(pg/mg),呈明显上升(P<0*5), 治疗组在再灌注 15 分钟和 3小时ET-l是 7*0士0.75、9*1土0.97(pg/mg) 下降明显,差异有显著性。 五、肾细胞调亡研究。 在再灌注 15分钟时,(调亡+坏死)细胞百分率在假手术组u.43士 l.07)、治疗组(8.98 t 2.15)与对照组(16.54 t


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