骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

【摘要】： 在个体发育进程中，全能干细胞或多能干细胞(胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等)发育为组织特异性干细胞(如神经干细胞、表皮干细胞等)，进而分化为定向祖细胞和终末分化细胞。各阶段的干细胞的研究都最近取得了重要的进展。1981年，鼠胚胎干细胞建系。鼠胚胎干细胞向心肌细胞、胰岛细胞、神经元、表皮干细胞、造血干／祖细胞等定向分化已经获得成功，1998年，美国James AThomson报道人胚胎干细胞建系成功，为人类器官、组织的治疗性克隆奠定了基础，进一步掀起了干细胞研究的热潮，已经有人胚胎干细胞向神经元、造血干／祖细胞定向诱导分化成功的报道，同时也引起了广泛的伦理、道德、法律争议，其免疫源性也是不容回避的难题。 最早在130年前，德国病理学家Cohnheim在研究创口愈合时就推测在创口愈合过程中出现的部分细胞可能来自骨髓。20世纪70年代，Friendenstein发现一小部分骨髓中贴壁最牢固的细胞经数此传代后形成独特的纺锤形外观，具有形成成骨细胞或软骨细胞的能力。80年代以来，许多研究小组进一步证实了Friendenstein分离到的这些细胞是多能的，在体外特定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经元等，被称为骨髓间充质干细胞(Bone MarrowMesenchymal Stem Cells，MSCs)。而且证实MSCs参与了创伤愈合。 骨髓间充质干细胞是一群有独特的生长特性的细胞。它表达多种表面标记物，大部分细胞处于静止状态。它向成骨细胞、脂肪细胞等定向分化是各种作用因子共同启动了有关的基因表达，如表达AKP，Osteocalcin，Osteopontin和PPARγ2，aP2等。 由于MSCs的相对容易的取材来源和培养扩增可能，以及不存在免疫源性和其固有的对造血组织的支持作用，可以克服胚胎干细胞的弊端，又具有独特的优势，成为胚胎干细胞以外的一重要研究领域。 浙江大学硕士学位论文 MSCs具有广阔的应用前景。在组织工程上作为种子细胞，经培养扩增后，与 不同的生物材料结合，形成组织工程化材料，修复骨、软骨、肌健等组织缺损。 细胞移植治疗上，有序地输注异基因MSCs，促进造血功能恢复。或者行细胞移植 于局部病灶，在局部微环境中定向分化为心肌细胞、神经细胞等。基因治疗上， 将外源性基因转人MSCS，使之有效并持久地表达产物，治疗缺乏循环蛋白导致的 疾病。或将有利于定向分化的生长因子基因转入MSCs，促进定向分化，提供MSCs 的后代，加速体内组织修复的进程。MSCS为创伤后瘫痪，阿海默氏症，心肌梗塞， 血友病B，创伤等疾病的治疗提供了新的思路和策略。 但是，各个研究小组的报道结果不尽相同。同时，来自外周血、脐血、肝脏、 真皮、胰腺的间充质干细胞的研究陆续出现，需要一个新的视角去看待来自不同 组织的间充质干细胞。 研究目的 本实验拟从骨髓分离、培养、扩增MSCS，流式细胞仪检测表面标记物和细胞 周期，并向脂肪细胞、成骨细胞定向诱导分化获得进一步证实，了解MSCs的生 物学特性，为今后在组织工程和创伤愈合中的研究奠定基础。 ＼ 材料和方法 取本院成人检查骨髓正常结果的骨髓标本（共35例）。技Pittenger的方法， 分离骨髓标本，取单个核细胞层培养、传代。取第3代的贴壁细胞达到80－90％融 合后，流式细胞仪 Becton Dickinson FACScan 检测 CD14PE／CD45－FITC， CD34－FITC／CD45－Percp，CD44－FITC，VLA－IFITC，HLA－D卜－PE，CD105－FITC， CD29PE的表达和细胞周期分析。10ug／ml胰岛素，luM地塞米松，0．smMI甲基－3－ 异厂基－黄膘吟，100UM间跺美辛的条什定向诱导 MSCS向脂肪细胞分化，第 7，14， 引大实验组与对照组均行油红 O染色。0．luM地塞米松，10 mM p－甘油磷酸钠， 50uM 2．磷酸－抗坏血酸的条件定向诱导 MSCs向成骨细胞分化。第 7，14，ZI无以 及第 8，10，16，旧无行改良钙钻法染色和定量检测 AKP的表达。第 8，10，16， 18，28天行 Von Kossa染色显示钙盐沉着。 结果 一MSCS的分离、培养： Percoll分离液（l刀739／ml）分离得到的单个核细胞 24小时后贴壁，细胞呈圆 2 浙江大学颀士学位论文 形，48－72小时后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培养约 14－20天左右 可达到80－90％融合。传代细胞24小时内完全贴壁，5－7天内达到80－90％融合。 35例标本，10例获得贴壁生长，