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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和细胞空泡毒素基因的克隆,表达和其融合蛋白免疫反应性的研究

陈喆  
【摘要】: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染呈全球性分布。发达国家成人的感染率约30~50%,发展中国家则超过80%。大量研究资料证明Hp是人慢性胃炎和消化性溃疡的特异性病原体,长期Hp感染与人胃癌和胃B细胞淋巴瘤的发生密切相关。目前临床上用抗生素治疗Hp的感染,但存在药物副作用、费用较高、再次感染等问题。更为重要的是,长期使用抗生素可诱导Hp耐药菌株产生,这给Hp再次感染时的抗生素治疗带来很大的困难。 接种疫苗所产生的人体特异性免疫力,具有稳定和长期的特异性抗感染作用。已有一些文献报告,Hp全菌裂解液可保护动物免受Hp感染,具有预防作用;也能清除动物体内已感染的Hp,从而具有治疗作用。几种Hp重组蛋白抗原在动物模型中已被证实能诱发保护性免疫反应,还可清除动物体内已感染的Hp。因此,Hp疫苗的研制及其应用对于Hp感染的防治、相关疾病的控制具有极为重要的意义。由于培养Hp的营养要求高、生长周期长、产量低、易污染、菌种保存困难等原因,基因工程疫苗应是Hp疫苗研制的主要方向。 所有Hp菌株均含有尿素酶(urease),该酶对于细菌在强酸环境中生存、粘附细胞等均有重要意义。由于Hp尿素酶具有细菌外膜中有分布、 浙江大学硕士学位论文 陈 益 高度保守、颗粒状结构、大分子量和强免疫原性等特点,最早作为Hp疫 苗的侯选抗原。业己肯定,尿素酶的抗原性主要取决于 B亚单位(UreB)。 早期的文献根据是否含有细胞毒性相关蛋白(Cytotokic associated protein, C渺)和细胞空泡毒素(vacuolatin Cytoxin protein. vacA)将Hp菌株分 为 agAhacA+和 cagA-/vaCA-两类,并认为 cagA+/vacA+菌株有致病性, 呻-/vacA坝否。从亚洲国家人群分离的Hp菌株中,约75%的菌株为 cagA+/vacA七因此,CagA和VacA可能是HP疫苗良好的侯选抗原。然 而,不少研究结果证实C渺基因变异很大,其产物C哪不宜作为疫苗的 抗原。vacA基因非常保守,不同 Hp菌株的 vacA基因核苦酸序列的同源 性高达90%以上,氨基酸序列同源性更高。此外,VaCA也具有细菌外膜中 有分布、大分子量和强免疫原性的优点。因此UreB和VaCA应是较为理想 的Hp疫苗抗原。 本文拟克隆 Hp的 ureB和 vacA基因并构建表达系统,其产物将作为 Hp基因工程疫苗的抗原,为 Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。 实验方法 1.Hp的分离培养 采集 26例患者胃粘膜标本,匀浆后涂布于含 10%抗凝羊血和抗生素添 加剂的Hp选择性培养基上,微需氧环境中37’C培养扣。若菌落细小、半 透明,菌体革兰染色阴性、呈弧状或“海鸥”状,快速尿素试验阳性,能 与Hp抗血清凝集者为Hp。 2.Hp DNA的制备 采用常规酚-氯仿法、无DNse的RNase消化提取及纯化Hp基因组 DNA。 3.*C丑 2 浙江大学硕士学位论文 陈 品 ureB基因的扩增:反应体积 50…,内含 lpmol/L引物、5 mol几 dNTP、40 mol/L MgCI。、2.SU Taq酶、IX PCR缓冲液及 100ng 模板。 PCR反应参数:94’C sinifi,ICyCle:94℃30SCC,58℃30SeC,68℃ 90秒,3o Cydes;72℃7mh,2。ydes。ureB扩增引物如下:上游 5’.GGAGAATTCATTAGCAGAAAAGAAMGTTTCT ATG-3’,下游 5’.GThCTCGAGC17ACGAAWCT777’GTTGCTTGACC.3’。 vacA基因的扩增:反应体积5口…,内含1卜mol几引物、5 mol几 dNTP、40 mol/L MgCI。、二.SU Taq酶、IX PCR缓冲液及 100ng 模 板。**R反应参数:94℃sin h,1。y。ie:94℃30s*。,58℃30s*c, 68’C90秒,30 cycles;72oC 7min,2 cycles。vacA扩增引物如下: 上游5’-GCGGAATTCATGGAAATACAACAAACACAC-3’,下游 5’.GGGCTCGAGAThGGTACCTGTAGAAACAT.3’。 4.TA克医、测序与表达载体的构建 用QIAqllick柱回收法纯化回收PCR目的片段,与pGEM1Easy载体 连接形成pGEM丁*卿个acA和pGEM*卫asyureB重组质粒。阳性菌落 克隆经酶切鉴定后,用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核昔酸序列。 所获得的序列与 GeneBank登录的 Hp ureB和 vacA序列进行核昔酸和氨基 酸同源性比较。 原核表达载体 pGEX上 q 的构建:EOOR和 wl双酶切 pGEM-T-Easy vacA和原核表达载体pGEX6 l质粒DNA


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