幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和细胞空泡毒素基因的克隆，表达和其融合蛋白免疫反应性的研究

【摘要】： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染呈全球性分布。发达国家成人的感染率约30～50％，发展中国家则超过80％。大量研究资料证明Hp是人慢性胃炎和消化性溃疡的特异性病原体，长期Hp感染与人胃癌和胃B细胞淋巴瘤的发生密切相关。目前临床上用抗生素治疗Hp的感染，但存在药物副作用、费用较高、再次感染等问题。更为重要的是，长期使用抗生素可诱导Hp耐药菌株产生，这给Hp再次感染时的抗生素治疗带来很大的困难。 接种疫苗所产生的人体特异性免疫力，具有稳定和长期的特异性抗感染作用。已有一些文献报告，Hp全菌裂解液可保护动物免受Hp感染，具有预防作用；也能清除动物体内已感染的Hp，从而具有治疗作用。几种Hp重组蛋白抗原在动物模型中已被证实能诱发保护性免疫反应，还可清除动物体内已感染的Hp。因此，Hp疫苗的研制及其应用对于Hp感染的防治、相关疾病的控制具有极为重要的意义。由于培养Hp的营养要求高、生长周期长、产量低、易污染、菌种保存困难等原因，基因工程疫苗应是Hp疫苗研制的主要方向。 所有Hp菌株均含有尿素酶(urease)，该酶对于细菌在强酸环境中生存、粘附细胞等均有重要意义。由于Hp尿素酶具有细菌外膜中有分布、 浙江大学硕士学位论文 陈 益 高度保守、颗粒状结构、大分子量和强免疫原性等特点，最早作为Hp疫 苗的侯选抗原。业己肯定，尿素酶的抗原性主要取决于 B亚单位（UreB）。 早期的文献根据是否含有细胞毒性相关蛋白（Cytotokic associated protein， C渺）和细胞空泡毒素（vacuolatin Cytoxin protein． vacA）将Hp菌株分 为 agAhacA＋和 cagA－／vaCA－两类，并认为 cagA＋／vacA＋菌株有致病性， 呻－／vacA坝否。从亚洲国家人群分离的Hp菌株中，约75％的菌株为 cagA＋／vacA七因此，CagA和VacA可能是HP疫苗良好的侯选抗原。然 而，不少研究结果证实C渺基因变异很大，其产物C哪不宜作为疫苗的 抗原。vacA基因非常保守，不同 Hp菌株的 vacA基因核苦酸序列的同源 性高达90％以上，氨基酸序列同源性更高。此外，VaCA也具有细菌外膜中 有分布、大分子量和强免疫原性的优点。因此UreB和VaCA应是较为理想 的Hp疫苗抗原。 本文拟克隆 Hp的 ureB和 vacA基因并构建表达系统，其产物将作为 Hp基因工程疫苗的抗原，为 Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。 实验方法 1．Hp的分离培养 采集 26例患者胃粘膜标本，匀浆后涂布于含 10％抗凝羊血和抗生素添 加剂的Hp选择性培养基上，微需氧环境中37’C培养扣。若菌落细小、半 透明，菌体革兰染色阴性、呈弧状或“海鸥”状，快速尿素试验阳性，能 与Hp抗血清凝集者为Hp。 2．Hp DNA的制备 采用常规酚－氯仿法、无DNse的RNase消化提取及纯化Hp基因组 DNA。 3．＊C丑 2 浙江大学硕士学位论文 陈 品 ureB基因的扩增：反应体积 50…，内含 lpmol／L引物、5 mol几 dNTP、40 mol／L MgCI。、2．SU Taq酶、IX PCR缓冲液及 100ng 模板。 PCR反应参数：94’C sinifi，ICyCle：94℃30SCC，58℃30SeC，68℃ 90秒，3o Cydes；72℃7mh，2。ydes。ureB扩增引物如下：上游 5’．GGAGAATTCATTAGCAGAAAAGAAMGTTTCT ATG－3’，下游 5’．GThCTCGAGC17ACGAAWCT777’GTTGCTTGACC．3’。 vacA基因的扩增：反应体积5口…，内含1卜mol几引物、5 mol几 dNTP、40 mol／L MgCI。、二．SU Taq酶、IX PCR缓冲液及 100ng 模 板。＊＊R反应参数：94℃sin h，1。y。ie：94℃30s＊。，58℃30s＊c， 68’C90秒，30 cycles；72oC 7min，2 cycles。vacA扩增引物如下： 上游5’－GCGGAATTCATGGAAATACAACAAACACAC－3’，下游 5’．GGGCTCGAGAThGGTACCTGTAGAAACAT．3’。 4．TA克医、测序与表达载体的构建 用QIAqllick柱回收法纯化回收PCR目的片段，与pGEM1Easy载体 连接形成pGEM丁＊卿个acA和pGEM＊卫asyureB重组质粒。阳性菌落 克隆经酶切鉴定后，用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核昔酸序列。 所获得的序列与 GeneBank登录的 Hp ureB和 vacA序列进行核昔酸和氨基 酸同源性比较。 原核表达载体 pGEX上 q 的构建：EOOR和 wl双酶切 pGEM－T－Easy vacA和原核表达载体pGEX6 l质粒DNA