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钙蛋白酶在过氧化氢诱发的白内障发生机制中的作用和氧化性白内障的预防

徐雯  
【摘要】: 氧化损伤是老年性白内障的首位危险因素。晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)担负着晶状体生长、分化和损伤修复的物质和能量代谢的任务。研究证实大多数白内障患者伴有LECs内Ca2’浓度的升高。钙蛋白酶(calpains)是一种全身广泛存在的中性限制性蛋白水解酶。在病理状态下,异常增高的Ca2’浓度可激活calpains,引起疾病的发生。CalpainⅡ在晶状体的表达中占主导地位。PD150606是一种特异性的、与calpains的Ca/结合位点高度选择性结合的、具有细胞膜高通透性的calpains抑制剂,已被证实对神经系统有较好的抗蛋白水解作用。 本研究从形态学水平、细胞学水平、蛋白质水平和分子水平四个层次研究了氧化性白内障的晶状体混浊程度、蛋白含量、晶状体水化程度、LECs凋亡数目、细胞内Ca2‘浓度及calpains的蛋白表达和水解酶活性的改变,以及calpains抑制剂PD150606对上述改变的抑制作用,探讨了以氧化性白内障动物模型研究老年性白内障发病机制的可行性,calpains在氧化性白内障发生机制中的作用及机理,以及PDl50606对氧化性白内障的预防作用。 一、氧化性白内障模型的建立 $江大学博士学位论文 DisscITlollforPh.D.ofZhdieqUni. 目的:将过氧化氢(HZOZ)诱发大鼠离体晶状体产生白内障作为实验模 型,通过对晶状体的透明程度、蛋白质中水溶性蛋白(wter-soluble protein. WSP)的含量及电泳条带、晶状体水化程度以及LECs凋亡数目的影咱,探讨 将氧化性白内障动物作为模型研究老年性白内障发病机制的可行性。 方法:用HZOZ诱发实验组离体培养的大鼠晶状体发生白内障,与对照组正 常晶状体相比,观察晶状体透明程度的改变并分析晶状体相对灰度值的变化, Folin-酚法测量晶状体蛋白质中WSP所占比例的改变,SDS4WGE结合考马斯 亮蓝染色分析WSP电泳条带的改变,测定晶状体水化程度的改变,并用流式细 胞术测定LECs凋亡数目的改变。 结果:经HZOZ作用的实验组,培养24h内,随作用时间的延长,晶状体逐 渐混浊。6h、12h和 24h时与对照组相比,相对灰度值减小,差异有显著性 (Ibdl刀32,0.000,0.000);WSP]IWSP和尿素溶性蛋白(llFCatSOIUbl6 protCID, USP)之和的比例减少,差异有显著性(P4:).oil,0.001,0.000):WSP的 SDS-PAGE电泳条带中,25kDa、29ica和30kDa处信号明显减弱;晶状体水 化程度增加,差异有显著性(P4)乃04,0.00,0.000):LECS凋亡数目增加, 差异有显著性(IxMI.000,0.000,0.000)。 结论:本研究证实HZOZ可诱发大鼠离体晶状体产生白内障,且其形态、蛋 白和细胞的改变与人的老年性白内障的改变相似,将氧化性白内障动物作为模 型研究老年性白内障发病机制中氧自由基的损害作用具有可行性。 二、氧化性白内障中LECS内对”浓度的变化 目的:通过测定H。O。诱发的白内障中LECS内CJ“浓度的变化,探讨CJ“ 浓度的改变在氧化性白内障发生机制中的作用。 方法:用HZOZ诱发实验组离体培养的大鼠晶状体产生白内障,用 FuraZIAM荧光标记法测定 LECs胞浆内叨”的浓度,并与对照组正常晶状体 2 浙江大学博士学位论文 DisscrTlon for Ph.D.ofhoieq Uni. 相比。 结果:经比Q作用的实验组,6h、12h和24h时,LeeS胞浆内C/”浓度 与对照组相比明显升高,差异有显著性(严吻.001,0.000,0.000)。 结论:本研究证实HzQ作用于大鼠晶状体后,其LECS内旷”浓度明显升 高,从而为Cf”依赖的蛋白水解酶如calpains等的激活创造必要条件。 J 三、氧化性白内障LECs中calpains的表达和酶活性的改变 目的:通过测定 C8lpsifl 11蛋白在HZOZ诱发白内障的 LECS中的表达和 calpains的Ca2+依赖的水解酶活性的改变,探讨闲 在氧化性白内障发生机制 中的作用。 方法:用HZOZ诱发实验组离体培养的大鼠晶状体发生白内障,用免疫组织 化学的方法研究 Calpain 11蛋白在H。O。诱发白内障的 LECS胞浆中的表达,用荧 光底物水解法测定LECs中比lpains的CaZ”依赖的水解酶活性的改变,并与对照 组正常晶状体进行比较。 结果:经HZOZ作用的实验组,6h、12h和 24h时与对照组相比,clpain 11 蛋白阳性表达细胞百分比增加,差异有显著性(P4).000,0.000,0.000); calpains的酶活性的荧光值增加,差异有显著性(P4.0(?


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