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树突状细胞在慢性病毒性肝炎发病机制中的作用

汤灵玲  
【摘要】: DC在病毒、细菌、寄生虫等病原体感染的过程中发挥极其重要的作用,在肿瘤、免疫性疾病的基因治疗方面也有可喜的应用前景。由于DC在机体内的含量很少,因此体外大量培养和扩增DC是研究其功能、阐述某些感染性疾病的发病机制和用于治疗目的的基础。外周血单核细胞是DC的前体细胞之一,从外周血单核细胞体外诱导扩增DC,取材方便、并可反复取材,细胞表型均一,有很好的应用价值。本研究拟建立从人外周血单核细胞诱导扩增大量DC的简便方法并进行表型鉴定,从而为今后开展疾病发病机制、 内科学(传染病)浙江大学博士学位论文 治疗和预防错施等方面的研究打下基础。 1.材料与方法 本研究采用文献推荐的GMAISF联合几一刺激单核细胞,体外大量扩 增DC的方法,并加以简化。步骤入下:①取健康成人白细胞成分血,分离 单个核细胞,调整细胞数为ZX10’细胞巾讯后用贴壁法纯化外周血单核细胞: ②用含rhGM*SFQ * rhIL-4Q0n帅)的RPMI 1640培养基, 37C 5%COZ培养单核细胞;第 3天半量换液,第 6天收集细胞(以下简称 DC6);@用相差显微镜和透射电镜进行形态学分析,计算 DC6细胞得率, 流式细胞仪分析 DC6表型;④以 INF a D0咖L)刺激DC6共 48小时, 进行流式细胞仪分析,同时设阴性对照。 2.结 果 门)形态学分析:用相差显微镜观察细胞的生长过程,可见①在均匀 贴壁的圆形细胞的单核细胞中加入30n g/mLg/mL hGMcSF和20n lir1Llir1L rhIL4, 数小时后细胞开始聚集,并逐渐形成大量细胞聚集体;②培养第3天,有大 量疏松粘附的增殖性细胞集落,并开始产生悬浮或疏松贴壁的形态不规则的 细胞;③培养第6天,有大量的悬浮细胞和少量疏松粘附的细胞团,细胞形 态极不规则,均有大量的胞浆突起,呈“树突样”或“毛刺样”。透射电镜 .观察DC6,可见细胞伸展出大量的胞浆突起,细胞核不规则,胞浆内有大 量的滑面、粗面内质网和高尔基体,并可见Birbec样颗粒,线粒体少见。 (2)DC6细胞表型流式细胞仪分析 根据FS/SS设门,结果提示 DC6的均质性好(图l-3A)。DC6的表型特点为CDla+、CDSDe、CD86+、 CD83一、CD14+(但较单核细胞表达水平下降,单核细胞的MnX为12.l)、 CD56.、CD3.、CD19。3次重复实验结果类似。且CDla+细胞比例分别为 98.5o、98.8o、99.8o,提示本方法所获得的DC6纯度高。 5 内科学(传染病)浙江大学博士学位论文 D)DC6得率 根据公式DC6得率一 昙钱绘刘%,3次细胞 ”“”““”IHrtpe ’I“ytl“““”’Hrt- $N$ft-“””””’“”“”““ 培养细胞得率分别为66.2%、57.3%和62.2%;平均为61.9%。 N)IN’---- a对细胞表型的影响 INFa臼0ng/mL)刺激 DC6共 48 ,J’时,重复3次实验,结果显示DC表达CD80、CD86以及CD83有不同 , 程度的增加。 3.讨 论 门)外周血单核细胞体外诱生DC 本研究采用白细胞成分血,通 过贴壁法纯化单核细胞;避免了全血的浪费,大大降低了使用磁珠分离技术 的高昂费用;而且本实验方法所得 DC6的得率平均为 61.9%(66.2%、57.3%、 62.2%),与文献报道相似。且DC6具有典型的外周血单核细胞来源的DC 的生长特点和形态学特征。 (2)本研究中DC6的表型特征为CDla+、CD80+、CD86+、CD3一、 CD19一、CD56-;与文献报道一致。而CDla+细胞比例非常高(98.5%,98.8%, 97.5%);提示DC6的纯度高,明显优于国内文献报道。 (3)结果还显示IN’--a可促进36表达CD83、CD80、CD86,由于 CD83是成熟DC的特征性标志,CD80、CD86参与了DC的淋巴细胞激活 功能,因而提示l’n7a可促使co成熟。 “4.结 论 采用本文的方法成功地从外周血单核细胞中体外诱导扩增DC,所得的 细胞具有典型的co形态学特征,并经细胞表型鉴定证实为nc;细胞得率 达到61.9%左右,可为进一步实验研究提供足量的细胞。本研究结果也同样 证明了 INI7 a能促使未成熟 DC的成熟。 6 内科学(传染病)浙江大学博士学位论文


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