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咖啡因在骨肉瘤细胞株化疗中增效作用的实验研究

万双林  
【摘要】: 实施有效化疗以来,骨肉瘤的5年无病生存率从以往的20%提高到现在的50%-70%,但仍有40%左右的病例,在治疗过程中复发或转移。如何提高这部分患者的化疗效果是目前亟待解决的问题。尽管有多种途径如多药耐药基因逆转等方法来提高骨肉瘤化疗的敏感性,但由于各方面条件的限制,未能取得重大突破。本课题通过系统的基础研究,探讨咖啡因提高骨肉瘤化疗敏感性、临床应用的可能性及其增效机制,为寻求简便有效的化疗增效方法提供实验依据,为骨肉瘤治愈率的进一步提高,制定一条切实可行的化疗新途径。 材料与方法  一、材料 人骨肉瘤细胞株(OS-732)购于北京积水潭医院创伤骨科研究所;RPMI-1640干粉、胰酶(均购自Gibco公司,美国);咖啡因、MTT(均购自Sigma公司,美国);顺铂(购自山东齐鲁制药厂);新生小牛血清(购自杭州四季青生物制品厂);FITC Fas抗体(购自Becton 浙江大学槽士学位论文 Dibkinson公司,美国);Tq INA多聚酶、逆转录酶(AMV)、RNA抑制 剂、dN’-n等均为美国Prraegs公司产品;Fas和p-actin引物均由上 海生物工程公司合成;恒沮水浴箱(上海医用恒辽设备厂);全自动酶 标仪(Sled60型,美国):流式细胞仪(Be CtOD DkMRSOfiFAChC811, 美国);倒置显微饬(olyEI)llS,日本);电子显擞镜(ffelips TECNAI荷 兰);紫外分光光度仪(Phcia Biotech,瑞典);Itlt热循环仪 (Perkin Elmer,美国);数字成像系统(IS1000型 Alpha Innotech, 美国)。 二、方法 1.细胞培养:纫血常规培养于体积分致为1(SF生小牛血清(经56℃、3odin 水浴灭括)的Rlyl-1640培养基中,其中含有音霉素100IU/.1及链霉素 100pm/ml,在37℃、体积分数为skTh、95%空气、饱和湿度下,o孵箱 内闭式传代培养,用传代后第3日处于指戮增殖期细胞备实验用. 2.细胞处理:根据细胞株与不同药物的作用过程进行分组,(1)43C或 37 ℃恒温条件下,细胞株分别与浓度为o、0.2、2.o、5.0、m.o、20.o——VL 的咖啡因(Caffeine)作用。(二)43℃或37℃恒温条件下,细胞株分别 与浓度为 0、0.1、1.0、10.opg/hl的顺铂(CISP18till)作用.(3)43t 或37℃恒温条件下,细胞株分别与浓度为0. 0.2、2.0. 5.0_1/L 的咖啡因和浓度为o、o.1、Lo、ic.0心。1的顺铂共同作用。43℃恒 温条件下细胞经lh处理后,分别用Hank氏液洗涤二遍,再用IIPMI-164=( f 培养液洗涤一迄,然后继续在37C的e嚼闰内培养72h. 3.温度控制:43C恒温条件采用电热恒温水浴箱加温(温度波动<土0.l ℃),将盛有细胞悬液的高心管置于水浴箱中加温(距液面4cm处)。 为保证温度准确并去除升沮时差,将温度计置于含相同体积培养液的 离心管内于同一水平面测温,温度达43℃时开始记时,加温时间为lh。 2 齿江大学博士学位论文 37C恒温条件采用体积分数为Wh、95K空气、饱和湿度的赐箱维持. 4.iT法测定:将处理过的细胞分别接种到96孔板上,每孔200pl(细 胞浓度为ZX10’ta),备设三个复孔,以IIPMI-1640用养液为空白对照, 以未经加温和/或 处理的细胞为阴性对照。将96孔板置于37℃、 体积分站为 skTh、95tgy气、讫和湿度的赐箱内墙养?2 h后,加 NTT 50PI/ 孔,继续培养4h,弃上清液,加二甲亚矾100pl/孔,在平板离心机上离 心 200()ro、smin,待结晶溶解后,用全自动酶标仪(Sina960型,波长 59oU)测定每一孔的吸光度J(旧称光密度皿)。重复实验三次,并计算 其细胞毒性指数值(Cytotoxicity Index,CI).CI=(阴性对照组d值 -试验组回值)/阴性对照组回值xlm凡。 5.I:ry分析:在43℃恒温条件下,细胞株经咖啡因、颐铂处理后,置流式 细胞仪进行DNA含量测定,将所得数据采用专用软件Nulticycle计算 各期细胞百分比,观察细胞周期变化;在37℃恒温条件下,细胞株经 咖啡因、顺铂处理后,置流式细胞仪进行DNA含量测定,将所得数据采 用专用软件holticycle计算


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