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银杏LEAFY同源基因的分离克隆及其相关基础研究

张建业  
【摘要】: 银杏(Ginkgo Biloba L.),又名白果,著名的孑遗植物,被誉为活化石,是珍贵的食用、药用、材用、观赏用树种。银杏又是严格的雌雄异株,还没有发现雌雄同株现象,其雌雄株在染色体核型,过氧化物同工酶谱等都有较大差异。雌雄花形态也截然不同,有的专家还认为银杏有性染色体。银杏果实营养丰富,味道鲜美,遗憾的是银杏的童期很长,被称为公孙树,实生树的开花需要十几年,严重制约着银杏品种改良和经济利用。为缩短银杏童期,果树工作者进行了大量的研究,从栽培方式,传统育种方法进行了探索,但成效不大。 近年来模式植物拟南芥的开花机理研究取得了很大进展。至少有80个以上与拟南芥开花有关的基因和位点被识别出来。其中LEAFY(LFY)是一个花分生组织特征基因,控制着拟南芥营养分生组织向花分生组织的转变,也影响拟南芥的开花时间。LFY的过量表达可以促使拟南芥、水稻、欧洲山杨、柑桔提早开花。虽然银杏是较古老的裸子植物,但由于LEAFY基因的保守性,银杏LEAFY同源基因也可能调控着银杏开花的时间。同时,银杏的遗传转化研究极少,也需要加以研究。为此,本实验从银杏LEAFY同源基因的克隆入手,分析其雌雄株LFY基因结构差异,构建LFY基因的植物正义反义表达载体,建立矮牵牛遗传转化体系,以研究银杏LFY同源基因的功能,同时建立了银杏组织培养体系,为银杏的遗传转化和提早开花结果奠定基础。 1.常规的CTAB法提取的银杏基因组DNA呈黄色,不易被内切酶所消化,也不能作为PCR模板。我们将CTAB法稍做改良:研磨样品时加入适量的不溶性PVP,提高β-巯基乙醇在提取液中的比例,从而提取到了无色、可酶解、可作PCR模板的高质量的银杏基因组DNA。 2.首次用银杏栽培品种大佛手(Ginkgo biloba L.cv.Dafushou)雄株基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得两个银杏雄株LEAFY同源基因GinLFY和GinNdly基因。 结果分析表明,GinLFY DNA序列全长为3450个核苷酸。经同源性分析和DNA序列结构分析,推测该序列为银杏雄株LEAFY全长基因。该基因与文献报道的银杏雌株LEAFY基因相比,核苷酸序列同源性高达99%,蛋白质序列同源 浙江大学博士学位论文 摘要 性达99%,缺少了3个核昔酸,突变均在植物LEAF’Y基因的非保守区内。从内 含子边界特征和多种植物LEAFY基因同源性比较,确定了该基因的内含子位置。 该基因含 2个内含子,3个外显子。GinNap全长基因含 1493个核昔酸,也含有 2个内含子,3个外显子。与文献报道的银杏雌株 GinNap基因相比,碱基数少 了三个,对应地少了一个丙氨酸,核昔酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.3%。 与拟南芥LEAF’Y基因相比较,银杏GinLFY和G毗基因没有做为转录激 活区域的位于氨基酸序列中间的酸性区和位于N端的富含脯氨酸区,但这两个 区域均位于LEAFY基因的非保守区。银杏雄株GinLFY和GinNdly之间氨基酸序 列同源性为 60.2%,这小于被子植物拟南芥 LFY与金鱼草 FLO之间的同源性(7 %)。另外,与拟南芥L厂Y同源性分别为50刀%和扔*%:与辐射松**FL L同源 性分别为80.3%和58.二%;与辐射松NEEDLY同源性分别为58二%和75石%。 3.利用p8I121和pCAMBIA1301两个植物表达双元载体质粒构建了心”以沙 基因的反义与正义植物表达载体PZJI 17、PZJlls、PZJllg、PZJ120等四个质粒。 pCAMBIA1301所带的报告基因GUS含内含子,使得GUS只能在真核细胞中起显 色反应。但它的多克隆位点旁侧没有启动子与终止子。构建 Gll7Ndl基因的植 物表达载体前,先给PCAMBIA1301加上了启动子和终止子,形成PCAMBIA1301 一 355—P帖质粒。然后利用限制性内切酶双酶切,构建成 PZJI 19和 PZJ120 质粒。PBI 121表达载体构建方法是酶切去除GUS基因,利用T4连接酶代之以 GinNdl基因,构建成PZJll7和PZJI 18。通过PCR检测和酶切验证,证明质粒 构建正确,并将之转入根癌农杆菌EHA105儿BA4404、GV3101和发根农杆菌15834 中。 4.利用叶片建立了矮牵牛遗传转化体系。培养基MS+BAZ.0+NAAO.4适于矮 牵牛叶片诱导愈伤组织,再生不定芽,每块愈伤组织上的不定芽数可达12个以 上,并且源源不断地发出不定芽来。经叶盘的农杆菌敏感性、抗生素耐受性实验, 建立了以叶盘为受体的矮牵牛遗传转化体系。利用含GinNdP基因的正义植物 表达载体质粒PZJI 17的根癌农杆菌EHA105转化矮牵牛,获得了一些抗卡那霉 素的抗性芽,经PCR检测证明,CinNdy基因己经整合到矮牵牛的基因组中。 5.银杏的组织培养银杏的子叶,胚轴,胚根,胚乳,茎段,叶柄,叶片, 根都可以诱导出愈伤


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