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传染性支气管炎病毒S1基因在马铃薯中的表达

吴建祥  
【摘要】: 传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性鸡传染病。该病目前无特效的治疗方法,主要使用IBV弱毒苗预防接种。由于活疫苗存在外源性或垂直传播性病原污染、毒力返祖等缺陷,开发安全、有效的新型疫苗是IB控制的研究重点。1992年Mason等提出了用转基因植物生产疫苗的概念。为了探索IBV可食性疫苗的可行性,我们进行了转基因马铃薯表达IBV免疫原基因及其表达产物免疫原性的研究,取得以下结果: 1 根据周继勇等报道的IBV-ZJ971毒株S1基因核苷酸序列和pBI121植物表达载体的多克隆位点,设计并合成引物,以含S1 pBS质粒为模板扩增S1基因,将扩增片段定向克隆到PBI121质粒的35S启动子下游。用三亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌,获得了含pBI121重组质粒的EHA105农杆菌菌株。 2 建立了马铃薯农杆菌介导的遗传转化体系,确定了马铃薯最佳愈伤诱导培养基及最佳分化培养基,愈伤形成率达100%,芽的分化率达90%以上。 3 将含外源基因的根癌农杆菌与马铃薯茎段共培养后在愈伤诱导培养基上培养7天,转接到分化培养基上分化出抗性芽,抗性芽在生根培养基上生根长成完整植株,共获83株。对所得到的抗性植株进行分子生物学检测,90%的再生植株PCR检测为阳性;Southern blot检测证明外源基因已整合到植物基因组内,大多数为二拷贝,Northern blot分析表明多数转基因植株中外源基因能正常转录,但转录水平不一,也有外源基因发生基因沉默。 4 将转基因植株在诱导结薯的培养基中暗培养结薯,培养7天开始结薯,1个月后产生大量重达0.2-1.0mg的试管薯。同时,将转基因马铃薯试管薯和植株成功移栽于田间繁殖。BALB/C小鼠免疫试验表明,1克转基因马铃薯剂量免疫小鼠后,21天的抗体ELISA效价达1:80—1:160,说明传染性支气管炎病毒S1基因的转基因马铃薯表达产物具有良好的免疫原性,这为IB植物疫苗的制备奠定基础。


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