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传染性支气管炎病毒S基因马铃薯生物反应器的建立

程丽琴  
【摘要】: 传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的急性高度接触性传染病。是当今危害养禽业最严重的疫病之一。 IB的控制主要依赖IBV弱毒疫苗的预防接种。使用活疫苗存在外源性或垂直传播性病原污染、毒力返祖等缺陷,开发安全、有效的新型疫苗是IB控制的研究重点。近年来,用转基因植物表达抗原相对传统的疫苗生产方式来说是更经济、有效和具有发展潜力的生产系统。已经有多种抗原基因在转基因植物中表达,并且植物中表达的抗原保持良好的免疫原性,并可刺激体液和粘膜免疫。本研究在克隆和分析IBV S1遗传变异规律的基础上,构建了IBV-H52 S基因的植物表达载体,并成功转化马铃薯植物,在抗性筛选的基础上进行分子生物学鉴定,最后对植物来源的疫苗免疫动物,进行免疫原性的研究。具体结果如下: 1.参照已报道的IBV-Beaudette株S1基因核苷酸序列,设计并合成一对特异性寡聚核苷酸引物,用TRIzol试剂抽提的IBV-Sc021202毒株的病毒RNA作为反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,扩增得到长度约1.9kb的S1基因,并经测序分析。结果显示:Sc021202毒株S1基因全长为1923bp,编码S1蛋白前体,共618AA,其中,1-18个为信号肽(在真核细胞中将被切除);19-618个为S1亚单位,共600个AA。 对获得的肾型毒株IBV-Sc021202的S1基因核苷酸及推导的氨基酸序列与GenBank中31个IBV毒株的相应序列用DNAstar、OMIGA等分析软件进行同源性比较和分析,结果表明,IBV-Sc021202毒株存在高度变异和相对保守区,含有插入和缺失突变,其中281、285和465位的氨基酸是独特的变异位点,其核苷酸与已报道的肾型毒株IBV-X、J的同源性较高,分别为94.4%和86.2%,氨基酸的同源性为94.5%和87.7%;而与肾型Holte、Gray等的核苷酸与预测氨基酸的的同源性较低,核苷酸为75.1%和72.5%,氨基酸的同源性在73.8%和73.10%;与其它毒株的核苷酸与预测的氨基酸序列的同源性在72.6-80.8%和73.1-81.8%之间。 2.用RT-PCR扩增IBV-H52S基因序列并测序分析,再利用重新设计的含XbaⅠ和BamⅢ酶切位点的引物,将获得的PCR产物定向插入植物表达载体pBI121 35S启动子下游,用三亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌EHA105,PCR及酶切鉴定,证实获得了含pBI121-IBVS质粒的农杆菌菌株。 3.通过农杆菌介导的遗传转化方法转化马铃薯茎段,在抗性筛选培养基上筛选,共获51株抗卡那霉素的再生植株。对所获得51个转基因马铃薯株系进行PCR检测,48株能够扩增出目的基因。 4.选取PCR鉴定为阳性的6个植株,用单一限制性内切酶酶切其基因组DNA,并进行Southern印迹杂交实验,结果表明,目的基因已经整合到马铃薯染色体上,整合的拷贝数 浙江大学博士论文 为卜,大多为2拷贝。 5.对5株马铃纫’山N。,比e,n1。kt纠果,多数转杜回植株,,1。夕「源某囚能丁常转录,*’ IVJ外源插入丛囚在RNA水个上得到了表达,转录水下有差异。 6.对N;;,讨;。,;;H川为m件的枪川【11捉蛋门进行SDS十MIZ电泳和伽s比r;。印)业杂灭纠 果表叫,切义个M川山泳介转从卜+,’帆w。J状测到竹殊的蛋肉条卅,们进 步的WCs比;T;「DI 迹杂交却未见I刊O蛋*杂交条卅,排测。。}能为及达员不够高。


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