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酵母生物转化生产S—腺苷—L—蛋氨酸辅产谷胱甘肽机理及工艺的研究

刘惠  
【摘要】: 本文主要涉及S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM-e或AdoMet,SAM)和谷胱甘肽(GSH)的生物合成、SAM的分离提纯及稳定盐产品的制备工艺与机理研究。 论文对SAM和GSH的性质、药理及应用、制备工艺的研究进展进行了详细的综述与分析,在此基础上确定了论文的研究内容。通过深入细致的研究工作,取得的主要研究成果包括: 1、利用啤酒厂废酵母,在外加L-蛋氨酸和葡萄糖的条件下,实现了酵母细胞同时生产SAM和GSH的目标,证明了在加入蛋氨酸生产SAM的同时得到了提高的GSH产量。确定了利用废酵母生产SAM的最适条件为:温度27~30℃内,pH6.0,K~+浓度为0.12M。当L-蛋氨酸加入量在0.7g/l以上时,摇瓶水平SAM的产量可达25-40mg.g~(-1),L-蛋氨酸转化率达30%以上,体积产量可达600~800mg/l。在15升发酵罐水平,当通气量为3.0vvm、搅拌速率500rpm,L-蛋氨酸浓度1.0g/l,葡萄糖浓度30g/l以及酵母密度(DCW)30g/l时,SAM的产量达45.8mg/g,体积产量1198mg/l,蛋氨酸转化率约44%,同时胞内还积累了17.0mg/g的GSH。实验结果表明。我国有丰富的啤酒厂废酵母资源,利用啤酒厂废酵母生产SAM及GSH可以实现废酵母的综合利用、提高废酵母的附加价值,具有良好的工业化应用前景。 2、通过对酵母菌株的产SAM能力的筛选,发现酿酒酵母ZJUS1在补加L-蛋氨酸的条件下具有较高的SAM生产能力;确定了利用酿酒酵母ZJUS1在间歇培养约一天后直接向发酵液内补加1.0g/l蛋氨酸、30g/l葡萄糖的培养—转化两步法同时生产SAM和GSH的策略;在摇瓶水平对转化阶段的操作条件进行了考察,确定了最适补加葡萄糖浓度为30g/l,最适补加L-蛋氨酸浓度为1.0g/l;对SAM和GSH合成的最适初始转化pH分别为5.0和6.0。15升发酵罐内培养—转化两步法实验数据表明,较高的溶氧水平及初始酵母密度有利于促进SAM产量的提高,而GSH在酵母胞内的积累表现在SAM合成的后期;在高溶氧水平(DO>40%),L-蛋氨酸的转化率高达37.4%,SAM体积产量达1003.9mg/l,干细胞产率为82.2mg/g,GSH的最高产量达0.92%(g/g),体 浙江大学博士学位论文 摘要 积产量达 140 mg/l。实验表明,培养酵母的 SAM合成能力大大高于啤酒厂废 酵母,但GSH积累水平大大低于啤酒厂废酵母。 3、对SAM和 GSH的合成机理、能量代谢在SAM和 GSH合成中的重要作用、 溶氧对酵母细胞好氧呼吸和厌氧代谢的影响及其对SAM和GSH积累的影响 机理进行了分析和讨论,在此基础上,建立了代谢溢流模型描述酵母细胞生 长、底物消耗和产品形成的动力学,模型较好地描述了间歇培养一转化过程。 上述工作为进一步改进酵母细胞同时积累 SAM和 GSH的工艺提供了理论基 础,为利用代谢工程改造酵母细胞指出了方向。 4、研究开发了利用苦味酸代替文献中采用的苦酮酸沉淀分离SAM,并结合溶剂 革取、溶解以及结晶方法的SAM分离和提纯制备工艺。结果表明,苦味酸是 一种选择性较好的沉淀剂,沉淀步骤得率在 90%以上,制备 SAM的硫酸盐的 总得率在60%以上,而硫酸对甲苯磺酸双盐的得率在50%以上,产物的纯度 达到了 95 %以上,已经达到了国外同类产品的质量指标。 5、通过筛选,获得了对SAM有较好选择性离子交换能力、较易洗脱和再生的争 光 D 113弱酸型阳高于树脂,研究了温度。pH等对 SAM离于交换的影响,根 据SAM在弱酸阳离子树脂Dll3上的等温交换平衡行为表现出较强的可逆性, 考虑到交换基(-COOH)的弱电解质性质以及结合Donan膜平衡理论,建立 了考虑pH影响的可逆离子交换平衡模型,该模型可以较好地描述SAM平衡 浓度、pH对离子交换平衡的影响:通过对动态离子交换过程的研究,得到了 SAM在 D 113树脂内的有效扩散系数的数量级为 1.OE习 cm勺s-1.OE8 cm一s。 6、研究开发了利用Dll3离子交换树脂结合聚苯乙烯类SD300脱色树脂的SAM 分离提纯工艺,该工艺可以得到98%纯度的SAM,Dll3弱酸型阳离子树脂 柱分离SAM的得率在90%以上,处理量为41.8 g SAMmter树脂;SD30O脱 色树脂柱的SAM得率达到了95%以上。 总之,通过本论文的研究工作,基本确定了利用啤酒厂废酵母和培养酵母生 产 SAM和 GSH的生物转化工艺;提出了以苦味酸沉淀和离子交换分离为核心的 两条分离提纯SAM的工艺路线;建立了生物转化和离子交换平衡的物理模型; 为在我国实现SAM的工业化生产打下了良好的基础。


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