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金属螯合亲和配基制备及其在分离豆壳过氧化物酶中的应用

文禹撷  
【摘要】: 本文综述了双水相分配技术的研究进展和现状,并着重就金属螯合亲和分配系统的形成、特点和应用,金属螯合亲和配基的制备,以及亲和分配技术在过氧化物酶分离中的应用进行了分析。 考察并优化了双水相成相聚合物—聚乙二醇(PEG)上螯合Cu~(2+)离子的反应条件:BF3的浓度、NaOH的用量、反应时间以及IDA的结合条件。发现环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比与IDA—PEG的IDA取代度相关,得到了不同Cu~(2+)含量的金属离子螯合配基(PEG-IDA-Cu(Ⅱ)-A(0.24 molCu~(2+)/molPEG)、PEG-IDA-Cu(Ⅱ)-B(0.51molCu~(2+)/molPEG)、PEG-IDA-Cu(Ⅱ)-C(0.75molCu~(2+)/molPEG))。环氧活化PEG的反应条件为:室温,BF_3浓度0.50%,40%wt.NaOH用量2.5%,反应时间20h;IDA与环氧活化PEG的反应条件为:2mol/L的Na_2CO_3溶液,亚氨基二乙酸与环氧—PEG的摩尔配比为20,反应温度65℃,反应时间24h。 采用甲醛滴定和旋光—真空干燥法分别测定了PEG4000/(NH_4)_2SO_4和PEG4000/PES100双水相系统中的PEG被不同金属离子含量的亲和配基取代时的相图变化,研究结果表明:加入金属整合亲和配基对该体系相图的双结点曲线的影响较小,基本可以忽略。对PEG4000/(NH_4)_2SO_4系统,随着PEG被金属螯合亲和配基取代量的增加,结线的斜率先减小到一个较小值而后逐渐增大,但直至PEG全部被PEG-IDA-Cu(Ⅱ)取代,结点线的斜率仍然比没有加入PEG-IDA-Cu(Ⅱ)体系的结线斜率小。 考察了金属螯合亲和配基PEG-IDA-Cu(Ⅱ)对豆壳过氧化物酶亲和分配的影响。在PEG/无机盐系统(PEG4000/Na_2SO_4和PEG4000/(NH_4)_2SO_4),随着体系中PEG被PEG-IDA-Cu(Ⅱ)取代比率的增加,豆壳过氧化物酶略趋向于上相。在PEG/PES系统中,豆壳过氧化物酶有相对较高的分配系数。系统pH对分配的影响很小。PEG分子量的减小(从4000到2000),PES分子量的增大(从100000到200000),酶的分配系数均增大;随PEG浓度的增加,分配系数逐渐增大;当PEG浓度大于10(%w/w),分配系数基本恒定。体系中PEG被PEG-IDA-Cu(Ⅱ)取代比率的增加,酶分配系数有所增大,趋于在上相富集。综合考虑得率和纯化因子,选取最佳条件为:PEG2000 10%,PES200 14%,PEG-IDA-Cu(Ⅱ)取代PEG比率为10%系统,该系统中过氧化物酶的分配系数为27,纯化因子为2.8,回收率达到96%。


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