2种蜜蜂和4种胡蜂溶血肽基因克隆与表达研究

【摘要】： 蜂毒溶血肽(Melittin)是意大利蜜蜂蜂毒的最主要成分，约占蜂毒干重的40％～50％。它具有很强的生物学活性，可引起红细胞裂解、脂质体释放标记离子以及肥大细胞释放组胺，同时它对细胞膜也具有很强的表面活性，其透过卵磷脂膜和混合脂膜的速度为任何表面活性剂所不及。因而，它是目前医药、生物工程及农业上家畜疾病的治疗和植物保护方面研究的重要原料。 首先本研究分别从中华蜜蜂、意大利蜜蜂工蜂和雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总RNA，通过RT-PCR方法扩增得到2种蜜蜂和4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA，再将扩增产物克隆到pGEM-T easy vector上。测序结果表明：扩增得到的片段长度均为213 bp，系蜂毒前溶血肽原编码区的cDNA，共编码70个氨基酸，包括由21个氨基酸组成的信号肽和49个氨基酸组成的溶血肽原，溶血肽位于其COOH端(第44～70残基)。经序列比较，2种蜜蜂和4种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过92％。中华蜜蜂、意大利蜜蜂和亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与东方蜜蜂印度亚种蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为97.2％、100％、93％、100％、97.2％、97.2％。结果表明，蜂毒前溶血肽原一级结构序列具很高的保守性，尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科，但它们的前溶血肽原基因却非常相似。以前胡蜂总科被认为不存在溶血肽基因，本研究首次揭示了胡蜂总科存在与蜜蜂相似的溶血肽基因。本文报道的中华蜜蜂、亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂和大胡蜂的前溶血肽原基因都已作为新的基因序列在GenBank登录，分别为：Apis cerana cerana prepromelittin mRNA(登录号AF487907)、Polistes hebraeus prepromelittin mRNA(登录号AF487909)、Vespula maculifrons prepromelittin mRNA(登录号AF487911)、Vespa velutina nigrithorax prepromelittin mRNA(登录号AF487908)、Vespa magnifica prepromelittin mRNA(登录号AF487910)。 利用GST基因融合表达系统构建了中华蜜蜂、亚非马蜂溶血肽基因的大肠杆菌诱导表达载体pGEX-AccM和pGEX-PhM，并在菌株BL21中进行了高效表达。二者的表达产物经Western blotting检测均具有很强的免疫活性，与预期目的蛋白分子量大小一致，三抗夹心ELISA检测结果也表明表达产物具有明显的免疫学活性。表达条件的优化实验表明pGEX-PhM和pGEX-AccM在IPTG诱导 下都能够在大肠杆菌 BInl中稳定高效表达融合蛋白，两者的诱导表达对 OD。、 IPTG浓度、温度以及诱导时间都有一定的选择性。在各自最佳条件而ODW为 1．0时，GSTACCM表达量可以达到细菌总蛋白的12．7－14．1％，GSTPhM表达量 可以达到细菌总蛋白的11．7％。溶血肽诱导家兔血小板的聚集实验也初步表明， 本研究表达产物经酶解回收后得到的溶血肽蛋白是具有一定活力的，但具体活 性仍有待进一步的研究。 同时，分别构建了中华蜜蜂和亚非马蜂溶血肽基因与谷肤甘肽基因融合的 重组杆状病毒BacmidGSTACCM和Bacmid－GSThhM，在粉纹夜蛾细胞系 Tn－SBI叶中进行了成功的表达。SDS－PAGE分析表明，感染Bacmid－GS 和BaCInd七SThhM Tn细胞的表达产物均在分子量约为34kD处出现特异性条 带，二者的表达量分别占Tn细胞总蛋白的7．3％和3．2％。Western blotting和三 抗夹心ELISA检测同时证明二者的表达产物都具有良好的免疫活性。感染 Bacmid－GSTACCM和Bacrnid－GSThhM的Tn细胞与感染阴性对照Bacmid的Tn 细胞状态相比，其感染症状没有明显区别，说明表达产物融合蛋白对细胞是没 有明显的毒性。溶血肽诱导家兔血小板的聚集实验也初步表明，本研究表达产 物经酶解回收后得到的溶血肽蛋白是具有一定活力的，但相比之下，亚非马蜂 溶血肽蛋白诱导家兔血小板的聚集活力相对较低，这与两者一级结构不同是不 是有关，有待研究。 此外，我们还将中华蜜蜂和亚非马蜂溶血肽基因与增强型荧光（GppT）基因 融合在杆状病毒．昆虫细胞表达系统中进行了表达，＝者的表达量分别占n细胞 总蛋白的 3．1％和 2．6％。Western blotting显不表达产物对His－Tagh Monoclonal Antibody和兔抗溶血肽（与卵清蛋白交联的总蛋白）多克隆抗体都具有良好的免 疫活性，在约34．6kD处均有一明显的条带，与预期目的蛋白的分子量大小一致。 感染 Bacmid－GFPTAccM和 Bacmid．GFP＊hM的 Tn细胞与感染阴性对照 Bacmid 的Tn细胞状态相比，其感染症状并没有明显区别，说明表达产物－融合蛋白 GFPTACcM和GFPTPhM对细胞也不具明显的毒性。 同时我们也分别构建了中华蜜蜂、亚非马蜂和额斑黄胡蜂前溶血肽原基因 与增强型荧光（GFPT）基因和 His Tag＋hV recognition site融合的重组杆状病毒， 分别在粉纹夜蛾细胞系Tn－SBI－4中进行了表达。ELISA检测表明三者的胞内表 达产物都具有良好的免疫活性，而胞外表达产物则均显阴性，说明各蜂前溶血 互互互 肽原基因的连有 HIS Tag或 EGFP的前溶血肽原蛋白没有穿膜，表达产物也不能 分泌出细胞外。前溶血肽原?