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二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因的分子生物学研究

吴志平  
【摘要】: 本论文以Bt毒蛋白Cry1Ab转基因水稻为材料,建立了从转基因植株中分离纯化外源基因表达产物Cry1Ab的二次高效液相离子色谱法;研究了处于有关缓冲溶液中的Cry1Ab蛋白构象性质及杀虫活性;以此为基础,用~(125)I标记二次色谱分离所得到的高纯度Cry1Ab蛋白,制得放射性探针;用该探针进行Western杂交实验证实了二化螟中肠存在Cry1Ab受体蛋白;进一步用分子生物学有关方法克隆到二化螟中肠Cry1Ab受体基因(Bt-R_3)cDNA全长序列,并在杆状病毒--昆虫系统中表达了Bt-R_3蛋白胞外结构域,Western点杂交实验显示表达产物能有效地结合Cry1Ab,从而确证所克隆到的Bt-R_3是Cry1Ab的受体基因;在这些研究的基础上,运用生物信息学手段分析了Bt-R_3蛋白的结构特性,Bt-R_3和文献已报导的几种Bt受体蛋白之间的分子进化关系以及它们氨基酸序列间的保守性关系,从而更进一步地证实了Bt-R_3确实是Cry1Ab的受体基因。具体结果如下: 1.高效液相离子交换色谱法从转基因水稻中分离、纯化Cry1Ab蛋白 建立了用高效液相离子交换色谱法(Ionic exchange high performance liquid chromatography, IEHPLC),从Bt毒蛋白Cry1Ab转基因水稻植株的提取液中富集、分离、纯化得到高纯度Cry1Ab的新方法。分离产物具有良好的生物活性。本法包含二步色谱分离过程,第一步为弱阴离子交换色谱,NaCl梯度洗脱,洗脱液A及B分别是10 mM Trisbase, 10 mM Trisbase内含0.18M NaCl pH 9.8,洗脱程序为:0~20min,洗脱液A由100%线性减至60%;20~60 min A由60%线性减至45%;60~90min A保持45%不变;洗脱液流量为1mL·min~(-1),215nm紫外检测,Cry1Ab的保留值为52.16 min,洗脱液pH值对色谱分离度和各组份保留值敏感,最佳值为9.8;第二步为阳离子交换色谱,流量为1mL·min~(-1),215nm紫外检测,pH为7.5,Cry1Ab的保留值5.21min,色谱操作温度8至10℃。 2.Bt毒蛋白Cry1Ab溶液构象性质及杀虫活性 用荧光光谱法研究了毒蛋白Cry1Ab在溶液中的构象。结果表明pH值增大时,毒蛋白的荧光强度也增大,至pH=11时荧光强度已达最大值;加入甲醇、乙醇、异丙醇等有机溶剂引起毒蛋白荧光发射波长蓝移和荧光强度增大,至有 机溶剂的浓度超过某一阈值后荧光发射波长不再蓝移;丙酮能完全碎灭毒蛋白 CrylAb的荧光,丙烯酸胺能碎灭CrylAb 86%的荧光而KI对毒蛋白天辟灭作 用,由此推断 Cry Ah的大部分色氨酸残基位于分子表面富含负电荷的区域中 ; CrylAb在所研究的四种不同的缓冲溶液中,杀虫毒性相似。 3.H化螟中肠CrylAb受体蛋白的鉴定、受体基因的克隆及其核苦酸序列特征 二化螟中肠蛋白质提取物,经SDS-PAGE门5%)电泳后电转移至硝酸纤维 素膜,然后用’nI放射性标记的Cry1Ab蛋白为探针进行Western结合实验, 证实二化螟中肠存在一种分子量约为 195 kDa的特异性结合蛋白。根据己克隆 到的Bt受体蛋白BtRI及BtR175保守区域的氨基酸序列设计简并引物,用 分子生物学方法克隆到一个全长为555fop的CDNA序列,其ORF编码一个由 1715个氨基酸残基构成的蛋白。将该基因命名为Bt-R3,对其核苦酸序列特征 进行了分析。 4.Bt受体基因mt-R3)在杆状病毒一昆虫系统中的表达 利用杆状病毒一昆虫 Bac to Bac系统表达了 Bt-R3基因的胞外结构片段, 并对表达产物进行了Western七lot结合实验,结果表明:表达产物能有效地结 合Bt毒蛋白CrylAb,从而证明BtR3确实是CrylAb的受体基因Z它们的结 合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中。 5.二化螟中肠Bt受体基因mt-R3)蛋白序列的生物信息学分析 将Bt-R3 蛋白氨基酸序列用BLAST软件对GenBalllUuDBJffiMBL、 SWISS个、Pth、PDB等数据库进行同源性搜索,用有关生物信息学软件分析 了所得同源性蛋白质序列,得到了B卜R3蛋白的结构特性、系统进化树,分析 了其可能的生物功能;用多重联配法分析了该蛋白的保守区域及有关功能结合 位点的特性。BtR3受体蛋白是钙粘蛋白超级家族中的一员,Bt-R3基因表达 的前体胰蛋白中含一由ZI氨基酸残基构成的信号肽;其成熟蛋白胞外区域由 9个类似于钙粘蛋白重复单元EC及一近膜结构MPR组成,Bt毒蛋白特异性 结合序列位于ECS结构域中,每2个重复单元的交界处总会出现卜 个Pro 残基;近膜结构下游有一由22个氨基酸残基组成的跨膜结构域,成熟蛋白共 有 6个潜在的 N一糖基化位点。BtR3受体是一个较强的酸性蛋白,和 Bt.RI 75 亲缘性最近;己克隆到的四种 Bt受体及舞毒蛾(Lyn。tria dispar)相关蛋白构成 且且 b 了钙粘蛋白的一个亚家族,这些蛋白质在昆虫体内的生理功能尚不清楚,可能 和维持虫体内分泌液离子组成有关。


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