二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因的分子生物学研究

【摘要】： 本论文以Bt毒蛋白Cry1Ab转基因水稻为材料，建立了从转基因植株中分离纯化外源基因表达产物Cry1Ab的二次高效液相离子色谱法；研究了处于有关缓冲溶液中的Cry1Ab蛋白构象性质及杀虫活性；以此为基础，用~(125)I标记二次色谱分离所得到的高纯度Cry1Ab蛋白，制得放射性探针；用该探针进行Western杂交实验证实了二化螟中肠存在Cry1Ab受体蛋白；进一步用分子生物学有关方法克隆到二化螟中肠Cry1Ab受体基因(Bt-R_3)cDNA全长序列，并在杆状病毒--昆虫系统中表达了Bt-R_3蛋白胞外结构域，Western点杂交实验显示表达产物能有效地结合Cry1Ab，从而确证所克隆到的Bt-R_3是Cry1Ab的受体基因；在这些研究的基础上，运用生物信息学手段分析了Bt-R_3蛋白的结构特性，Bt-R_3和文献已报导的几种Bt受体蛋白之间的分子进化关系以及它们氨基酸序列间的保守性关系，从而更进一步地证实了Bt-R_3确实是Cry1Ab的受体基因。具体结果如下： 1．高效液相离子交换色谱法从转基因水稻中分离、纯化Cry1Ab蛋白 建立了用高效液相离子交换色谱法(Ionic exchange high performance liquid chromatography, IEHPLC)，从Bt毒蛋白Cry1Ab转基因水稻植株的提取液中富集、分离、纯化得到高纯度Cry1Ab的新方法。分离产物具有良好的生物活性。本法包含二步色谱分离过程，第一步为弱阴离子交换色谱，NaCl梯度洗脱，洗脱液A及B分别是10 mM Trisbase, 10 mM Trisbase内含0.18M NaCl pH 9.8，洗脱程序为：0～20min，洗脱液A由100％线性减至60％；20～60 min A由60％线性减至45％；60～90min A保持45％不变；洗脱液流量为1mL·min~(-1)，215nm紫外检测，Cry1Ab的保留值为52.16 min，洗脱液pH值对色谱分离度和各组份保留值敏感，最佳值为9.8；第二步为阳离子交换色谱，流量为1mL·min~(-1)，215nm紫外检测，pH为7.5，Cry1Ab的保留值5.21min，色谱操作温度8至10℃。 2．Bt毒蛋白Cry1Ab溶液构象性质及杀虫活性 用荧光光谱法研究了毒蛋白Cry1Ab在溶液中的构象。结果表明pH值增大时，毒蛋白的荧光强度也增大，至pH=11时荧光强度已达最大值；加入甲醇、乙醇、异丙醇等有机溶剂引起毒蛋白荧光发射波长蓝移和荧光强度增大，至有 机溶剂的浓度超过某一阈值后荧光发射波长不再蓝移；丙酮能完全碎灭毒蛋白 CrylAb的荧光，丙烯酸胺能碎灭CrylAb 86％的荧光而KI对毒蛋白天辟灭作 用，由此推断 Cry Ah的大部分色氨酸残基位于分子表面富含负电荷的区域中 ； CrylAb在所研究的四种不同的缓冲溶液中，杀虫毒性相似。 3．H化螟中肠CrylAb受体蛋白的鉴定、受体基因的克隆及其核苦酸序列特征 二化螟中肠蛋白质提取物，经SDS－PAGE门5％）电泳后电转移至硝酸纤维 素膜，然后用’nI放射性标记的Cry1Ab蛋白为探针进行Western结合实验， 证实二化螟中肠存在一种分子量约为 195 kDa的特异性结合蛋白。根据己克隆 到的Bt受体蛋白BtRI及BtR175保守区域的氨基酸序列设计简并引物，用 分子生物学方法克隆到一个全长为555fop的CDNA序列，其ORF编码一个由 1715个氨基酸残基构成的蛋白。将该基因命名为Bt－R3，对其核苦酸序列特征 进行了分析。 4．Bt受体基因mt－R3）在杆状病毒一昆虫系统中的表达 利用杆状病毒一昆虫 Bac to Bac系统表达了 Bt－R3基因的胞外结构片段， 并对表达产物进行了Western七lot结合实验，结果表明：表达产物能有效地结 合Bt毒蛋白CrylAb，从而证明BtR3确实是CrylAb的受体基因Z它们的结 合部位位于Bt－R3蛋白的胞外结构域中。 5．二化螟中肠Bt受体基因mt－R3）蛋白序列的生物信息学分析 将Bt－R3 蛋白氨基酸序列用BLAST软件对GenBalllUuDBJffiMBL、 SWISS个、Pth、PDB等数据库进行同源性搜索，用有关生物信息学软件分析 了所得同源性蛋白质序列，得到了B卜R3蛋白的结构特性、系统进化树，分析 了其可能的生物功能；用多重联配法分析了该蛋白的保守区域及有关功能结合 位点的特性。BtR3受体蛋白是钙粘蛋白超级家族中的一员，Bt－R3基因表达 的前体胰蛋白中含一由ZI氨基酸残基构成的信号肽；其成熟蛋白胞外区域由 9个类似于钙粘蛋白重复单元EC及一近膜结构MPR组成，Bt毒蛋白特异性 结合序列位于ECS结构域中，每2个重复单元的交界处总会出现卜 个Pro 残基；近膜结构下游有一由22个氨基酸残基组成的跨膜结构域，成熟蛋白共 有 6个潜在的 N一糖基化位点。BtR3受体是一个较强的酸性蛋白，和 Bt．RI 75 亲缘性最近；己克隆到的四种 Bt受体及舞毒蛾（Lyn。tria dispar）相关蛋白构成 且且 b 了钙粘蛋白的一个亚家族，这些蛋白质在昆虫体内的生理功能尚不清楚，可能 和维持虫体内分泌液离子组成有关。