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螺旋藻高产多糖种质与生产条件优化研究及分子机理初探

马美萍  
【摘要】: 多糖不仅是所有生物有机体的重要组成成分,而且具有重要而独特的生物学活性。但由于生物活性多糖是一种次生代谢物质,它们在生物体中的含量一般都较低,往往达不到大规模产业化开发的要求,这是当前国内外在多糖类物质产业化研发过程中遇到的主要瓶颈问题之一。螺旋藻系一种光合放氧的原核丝状蓝细菌,是当前国内外研究与开发规模最大的经济微藻。众多研究与临床实践表明,螺旋藻多糖的分子结构独特,并具有高效的抗肿瘤、抗辐射及抗病毒等生理活性功效,是近年来国内外研究与开发的热点。目前生产上所用的普通钝顶螺旋藻或极大螺旋藻的多糖含量普遍较低(2~6%),品种(系)间的差异较大且受营养与环境因子影响也较大,加之多糖分离纯化时要反复多次除去大量的蛋白质,致使螺旋藻多糖的提取率很低、制备成本昂贵,其产业化进程受到严重制约。需要进一步指出的是,目前有关螺旋藻多糖的研究,大多侧重其分离纯化及结构与功能方面,而在高产技术方面则很少涉及。因此,利用核技术及相关生物技术选育高产多糖的螺旋藻新品系,建立高产多糖的最佳生产模式,研究并阐明螺旋藻多糖的生物合成机制,对实现螺旋藻生物活性多糖的产业化与实际应用,具有重要的理论与实践意义。本论文就此开展了一些研究,并取得如下主要结果: 1、螺旋藻多糖含量测定方法的建立与优化 针对现有一般的硫酸—苯酚法测定螺旋藻多糖含量,往往存在数据波动较大、重复性不好等问题,通过研究建立了螺旋藻多糖含量的测定方法。(1)一般测定均用葡萄糖为标准品,它与硫酸、苯酚反应后生成物的最大吸收波长为490nm。而我们用纯度高达95%的螺旋藻多糖(Sp-Std)为标准品,其与硫酸、苯酚反应后生成物的吸收光谱与被测螺旋藻样品提取物的基本一致,且最大吸收峰均为484 nm,从而提高了测量的准确性;(2)确定浓硫酸体积与反应体系总体积比为5.5:8.5,并用移液管而不用取液器定量与加入;(3)反应的最佳环境温度为25℃,加入浓硫酸30min后反应达到平衡,并在此后的60min内比色完毕可保证数据的稳定性;(4)多次实验表明,上述方法测定多糖含量的线性范围至少是目前一般方法的2倍,上限可达320μg,且A_(484)与多糖含量的相关系数高达0.999、斜率 为0刀069;*)利用改进后的硫酸一苯酚法测定螺旋藻样品的多糖含量,5个重复 样品多糖含量的平均值为3.58%、相对标准偏差RSD=1.33%,说明所建方法数 据稳定、重复性好、灵敏度高。 2、不同基因型螺旋藻多糖合成特性比较及高产多糖出发品系的确立 所测的株钝顶螺旋藻品系的多糖含量为二~6%,平均值为3.刀%。其中SpD。 SP*、SP七、SPS和 SP*的多糖含量相对较高。进一步分析上述5株多糖含量 较高的螺旋藻的总 DNA发现,SpE、Sp-S和 Sp-B这3株螺旋藻比 SpD和 SpJ 多了一段约为 11 00 hp的 DNA小片段,从而表明它们的分于遗传背景不同。 以即一E和 Sp-D为材料,进一步研究了 Mgu、K”、SO。Z、NO。”& C/N、w”、 C/P等营养因子对这2株不同基因型螺旋藻的生长及多糖合成的影响。实验统计 结果表明,由于Sp*和Sp-D分于遗传背景的差异,使得前者的生长率和产糖率 分别比后者的高6刀6%和二0.9%。因此,以SpE为出发品系更有利于获得生长快、 多糖含量高的目标突变体。 3、高产多糖螺旋藻新品系的选育及其培养条件的优化 用 0.60的 EMS和 2.4 kGy的m Y一射线复合诱变处理钝顶螺旋藻印上细胞, 待其长成藻丝体后以较高剂量的Y一射线为选择压力,辐射剂量逐步提高,直至筛 选到 1株致死剂量队D)高达 7.0 kGy的株系,并记为印上mPS),而其亲本和上的 LD仅为 6.3 kGy。根据螺旋藻多糖含量与辐射抗性呈显著的线性相关性 )-0.9873),初步推知 SpE(HPS)可能是 1株高产多糖的目标突变体。 通过比较SpEmPS)与Sp*在ZS.uollk\培养液中的生长速率和产糖率表明, Sp*(HPS)的生长速率及多糖含量与产糖率分别比其亲本SpE的高22厂%上3.0% 和SO.9%。这不仅表明Sp风*陀)是1株生长快且多糖含量较高的突变体,而且 证明可用高剂量的Y一射线作为压力筛选多糖含量高的突变体。 进一步研究了培养温度、时间与光照强度,以及培养液Mgy、K\SO/”、 NO3斥 HCO3“等对 SpE(HPS)生长与多糖合成的影响。单因子试验结果表明, Sp上(HPS)多糖合成的最佳生长条件为:温度 30OC、光照强度 4000 LllX、Mg卜 10 mg/L、K”560 mg/L、NO。-876 mg/L、SO/“982 mg/L、HCO士 12,3 g/L,并研究 发现对数生长后期藻体的多糖含量约是对数生长前期与对数生长期的2倍。同时, 统计分析结果表明,上述营养盐离子中 K长 SO/”对SpE(HPS)多糖合成的影响 最显著,HCO。“次动,Mgy和 NO二不显著。 三互 /; 同时,利用上述营养因于对多糖合成影响的研究结果,考察 SpE 讨 Sp上 中遗传因子对多糖合成的贡献率。结果表明,两者产


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