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蜜蜂和胡蜂蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的克隆与表达

张素方  
【摘要】: 蜂毒,包括蜜蜂蜂毒(honeybee venom)和胡蜂蜂毒(vespid venom),是古今中外应用广泛的天然药物,具有重要的开发利用价值。蜂毒明肽(apamin)、镇静肽(secapin)和肥大细胞脱粒肽(MCDP)是蜜蜂蜂毒的3个主要的多肽,在医学、分子生物学研究等方面均具有重要的研究开发利用价值;蜂毒过敏原抗原5(allergen antigen5,Ag5)是胡蜂蜂毒的主要过敏原之一,在蜂毒的过敏诊断和治疗上有重要的应用价值。目前,我国所开展的蜜蜂蜂毒分子生物学研究不多,而胡蜂蜂毒的研究又几近空白。本论文开展了蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的克隆与表达研究,首次证明了胡蜂总科存在与蜜蜂相似的明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽基因,并同时将它们在大肠杆菌和昆虫细胞中进行了表达;同时,我们还首次克隆到了额班黄胡蜂过敏原抗原5基因,并将其在原核和真核两个表达系统中进行了高效表达。本文是国内首次开展的胡蜂蜂毒的分子生物学研究。 主要结果包括下列四个部分: 1.蜂毒明肽基因的克隆与表达 (1)用RT-PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂、额班黄胡蜂和亚非马蜂蜂毒前明肽原基因的编码区,序列全长均为141 bp,这6种蜂的前明肽原都是由46个氨基酸残基组成,预测的分子量都为5.1kD。根据氨基酸联配结果,6种蜂的前明肽原可分为两种类型,而6种蜂的明肽是完全保守的。利用3’RACE方法克隆到了中蜂明肽3’非编码区的162bp序列,与意蜂的相应序列有91.4%的同源性,主要的变化是中蜂在226bp处分别有1bp的插入,而在236和237bp位置则有2bp的缺失。 (2)将中华蜜蜂前明肽原与3’非编码区部分序列和成熟肽与3’非编码区部分克隆,分别构建了前明肽原与谷胱甘肽转移酶(GST)和明肽与GST融合表达载体pGEX/AccPPapamin和pGEX/AccApamin。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进 浙江大学博士学位论文 行融合表达。两者的表达产物经 SDS-PAGE分析,分别在 28kD和 3 IkD处产生特异 性的表达条带,均与预期分子量大小一致;以抗GST抗体的Western印迹分析也证实 了中蜂明肽和前明肽原的表达产物在 28th和 3IkD处有很强的交叉反应,表明中蜂明 肽和前明肽原与GST融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。明肽与GST融合蛋白的表 达产物约占总蛋白的 3 0%,通过表达条件的优化,表达的目的蛋白多为可溶性融合蛋 白。通过GST亲和层析柱回收和凝血酶的切割,得到了中蜂明肽蛋白。 (3)应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中快速表达了中蜂明肽与增强型 绿色荧光蛋白(EGFP)基因的约34to的融合蛋白,表达的特异性蛋白(表达量)占 Tn细胞总蛋白的 10.9%。以鼠抗 His抗体作 Western印迹分析,发现表达产物在约 34 kD处有明显的阳性条带,与预期目的蛋白分子量大小一致。 二.蜂毒镇静肽基因的克隆与表达 (l)用 RT-PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂。大胡蜂、墨胸胡蜂、额斑黄胡 蜂和亚非马蜂蜂毒前镇静肽原基因的编码区序列,全长均为234 hP,这6种蜂的前镇 静肽原都是由77个氨基酸残基组成,预测的分子量都为8.skD。根据氨基酸联配结果, 意蜂杭州种群、墨胸胡蜂、大胡蜂、亚非马蜂、中蜂和额斑黄胡蜂与欧洲意蜂前镇静 肽原同源性分别为97%、96%、93%、93%、85%和85%;亲缘关系不同的6种蜂彼此之间 的同源性都大于85%。从代表成熟肽(镇静肽)的最后25个氨基酸序列看,亲缘关系 不同的6种蜂的镇静肽可以分为三种类型,意蜂(杭州和欧洲种群)、大胡蜂和墨胸胡 蜂为第一种类型,亚非马蜂为第二种类型,中蜂和额斑黄胡蜂为第三种类型。从6种 蜂前镇静肽原氨基酸序列所作的进化树可见墨胸胡蜂、意蜂(欧洲与杭州种群)、大胡 蜂和亚非马蜂前镇静肽原同处一个分枝中,中蜂与额斑黄胡蜂处在另一个分枝中。中 蜂与额斑黄胡蜂,墨胸胡蜂与意蜂(欧洲与杭州种群)前镇静肽原的同源性最高。6 种蜂的蜂毒前镇静肽原的亲缘关系与这6种蜂的亲缘关系并不完全一致。 u)以 3’RACE方法,扩增和测定了中蜂镇静肽基因 3’端非编码区 219 hp序列。3 端非编码区 CDNA序列与欧洲意蜂序列有刀.1%同源性。将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟 肽编码区与3’非编码区部分克隆,构建了镇静肽与GST 融合表达的载体 pGEX/Accsecapin。将载体转化大肠杆菌 BLZI(DE3)进行融合表达。表达产物与抗 GST抗体在29kD处有很强的交叉反应。镇静肽与GST融合蛋臼的表达产物约占总蛋 且互 q 浙江大学博士学位论文 白的30%,通过优化表达条件,表达的目的蛋白多为可溶性融合蛋白。通过亲和层析 柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白。本研究是首次通过重组技术获得了仅 3刀kD的中蜂蜂毒镇静肽。 ()应用 Bac-to习ac杆状病毒表达系统在昆虫细胞


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