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啤酒大麦赤霉病菌拮抗细菌分子鉴定及其作用机制研究

沈卫锋  
【摘要】: 对本实验室现存的52个细菌菌株,在不同培养基(PDA、KMB、TSA)平皿上与大麦赤霉病菌(F.graminearum)作对峙培养,结果发现CC41等22个菌株表现出较强的平面拮抗作用。将这22个表现拮抗的菌株用KMB培养液进行发酵,发酵液通过离心、过滤制成无菌代谢产物液后再测定它们对F.graminearum的抑制能力,结果表明菌株CC41经72小时发酵后的代谢产物对大麦赤霉病菌(F.graminearum)有最强的抑制作用,抑制率达75.4%。对其无菌代谢产物液用70%饱和度的硫酸铵在0℃下进一步沉淀,离心后所得的上清液对F.graminearum基本失去了拮抗能力,由沉淀制成的拮抗粗提液抑制率高达76.2%,将拮抗粗提液经100℃高温处理后其抗菌活性基本不变,这说明菌株CC41经发酵后的代谢产物中起抗菌作用的有可能是一种或一种以上的肽类抗生素,且对热稳定。在不同通气量条件下对CC41进行发酵,其代谢产物对大麦赤霉病菌(F.graminearum)的抑制能力没有差异;用A、B、C三种不同的培养配方进行发酵,其中配方A、C所得到拮抗粗提物的抗菌活性相近,但比配方B高。 利用传统的形态学观察菌株CC41的特征,发现菌体呈杆状,大小为0.75×μm,革兰氏反应呈阳性,能产生芽孢;在KMB培养基平皿上菌落呈浅黄色,近圆形,表面干燥、起皱、不透明。进一步对葡萄糖产酸等10个生理生化指标进行测定,并结合形态学观察结果,初步确定菌株CC41为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。利用PCR技术对菌株CC41的16S rDNA作全序列分析,序列结果在Genebank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析。结果显示CC41与已报道的B.subtilis 16S rDNA序列(登陆号:AB065370)有99.2%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。结合形态学、生理生化特征及16S rDNA全序分析,确定CC41为B.subtilis的一个菌株。 利用PCR技术从质粒模板pGFPuv中扩增了改良的绿色荧光蛋白基因(GFPuv)和乳糖操纵子(Lac),并进行了序列测定。为表达载体pRGL的进一步构建、菌株CC41的GFP标记及其在大麦穗部的定殖研究打下了基础。


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