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树突状细胞与白细胞介素18基因修饰的NCI-H460肺癌细胞融合体抗肿瘤作用实验研究

张在云  
【摘要】: 树突状细胞(Dendritic cells,DC是目前所知功能最强的抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APC),在机体的抗肿瘤免疫中具有重要作用。基于DC的肿瘤疫苗成为肿瘤免疫学研究的热点。DC疫苗的构建方法包括DC体外扩增后回输,细胞因子基因修饰DC,抗原基因转染DC,肿瘤细胞mRNA冲击DC、肿瘤抗原多肽冲击DC、肿瘤细胞裂解物冲击DC、肿瘤细胞与DC融合等。其中肿瘤细胞与DC融合更具优势,较为理想。白细胞介素(Interleukin,IL)-12、IL-7、IL-18、粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子具有较强的免疫促进作用,与DC疫苗联用有望提高DC疫苗的免疫效力,其中IL-18为多效性细胞因子,具有显著的抗肿瘤作用,将IL-18基因修饰与DC疫苗相结合可能会增强DC疫苗的免疫效应。 为探索更为高效的DC瘤苗,本实验将肿瘤抗原、DC的抗原呈递功能和细胞因子IL-18的免疫刺激活性相结合,构建含IL-12 P40信号肽序列的IL-18融合基因,以其转染NCI-H460肺癌细胞株,将此转基因细胞与DC融合,刺激活化T细胞,研究其在体外及动物体内的抗肿瘤作用,并与未转染融合细胞及NCI-H460细胞裂解物冲击DC诱导的T细胞的作用比较,以明确IL-18修饰的DC融合疫苗诱导的免疫作用是否优于后二者。 本实验分为五部分: 第一部分 DC的诱导培养和鉴定 分离外周血单个核细胞(Peripheral blood monoeuclear cell,PBMC),经贴壁获得单核细胞,用含GM-CSF和IL-4的培养液恒温培养,第5天起加肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)α100ng/mL刺激DC成熟,倒置显微镜下观察细胞形态;第8天取DC行电镜扫描鉴定形态; 浙江大学 博士学位论文 用流式细胞仪检测DC表面CD14、CDla、CD54、CD83、CD86和HLA-DR的表达;用CD3 磁珠筛选T细胞,用四甲基偶氮哩蓝(MTT)法测定DC对T细胞增殖的影响,以鉴定DC的 功能。结果培养第8天倒置显微镜下细胞表面具有大量突起和毛刺,扫描电镜示DC呈棘状, 符合*C的形态:*D14低表达,*Dla、**54、**83、*D86和**A.*R高表达;能明显刺 激T细胞增殖。经过形态、表型和功能鉴定,成功诱导了具有功能的成熟DC。 第二部分分泌型人 IL-18重组质粒的构建 用Triz。l一步法自LPS刺激的人PBMC中抽提总RNA,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcrlPtase Polymerase chain re。non,RT-PCR)分别扩增巳-12P40的信号肽序列和 IL.18的成熟 肽序列,用重叠延伸法拼接扩增含前二者的融合片段:将其连接于帅**-T克隆载体,转化 JM109菌株,挑取阳性克隆扩增后,提取质粒,酶切鉴定,取含融合基因片段的菌液,测序鉴 定;取序列正确的质粒,酶切质粒及pCDNA3.广表达载体,二者连接后转化JM109菌株,挑取 阳性克隆,提取质粒,取酶切鉴定含融合基因片段的菌液,行序列测定,将序列正确的克隆扩 增、冻存。结果经RT-PCR扩增的片段与u-12P40信号肽序列和JL-18的成熟肽序列的预计长 度相符合;重组克隆质粒和重组表达质粒的酶切片段符合预计结果;序列测定结果与设计完全 符合。表明成功构建了含 IL-12 P40信号肽序列的 IL-18融合基因的重组质粒。 第三部分分泌型人 ILIS的真核表达 常规培养NCIH460细胞,取对数生长期细胞,用脂质体转染上述重组质粒及pCDNA3.l+ 空载体,经 G4筛选,用无菌移液枪在倒置显微镜下吸取克隆,经 3-4周筛选培养后,行 RT-PCR 检测融合基因 mRNA表达,并检测空载体转染细胞 G4抗性基因 mRNA的表达,取细胞培养 上清液,浓缩并过滤后行 Western blot分析转染细胞 ILIS蛋白的表达,用 MTT法测定转染细 胞培养上清对 T细胞增殖的影响,以判断所表达的 IL-18有无生物学功能。结果 RT-PCR示基 因转染细胞有融合基因表达,而转染空载体细胞及未转染细胞均无表达:Western Blot示基因转 染细胞上清中有 18Kda的蛋白表达;基因转染细胞明显刺激 T细胞增殖。经 G4筛选、mRNA 测定、蛋白表达检测及所表达蛋白的功能测定,表明 NCIH460细胞成功转染了 IL-18融合基因 并稳定表达了具有生物学功能的成熟 IL-18。 第四部分 DC与 ILIS修饰的 NCI.H460细胞融合 DC的诱导培养同第一部分。NCIH460细胞及融合基因转染细胞常规培养,按DC与前H 者比例 2*分别用聚乙=醇(polyethylene glycol,PEG)法将 DC与 NCI-H460细胞及融合基因 3 浙江大学 博士学位论文 转染细胞融合,用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiacyanate,FITC)标记的cD83抗体标记融 合细胞后,经抗FITC磁珠筛选,用流式细胞仪检测融合细胞藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)标 记的CD86的表达,用MTT法测定两种融合细胞对T细胞增殖的影响,以NCIH460细胞为对 照。结果经磁珠筛选,融合细胞CD86表达率为(95.97土4


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