双重免疫分子膜表面修饰疫苗的制备及抗肿瘤作用的研究

【摘要】： 1971年Burnet提出肿瘤免疫监视概念，认为机体免疫系统能够识别并通过细胞免疫机制破坏肿瘤细胞。如果机体的免疫监视功能低下或缺陷，就有可能形成肿瘤。肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的可能机制包括：1)MHC分子的下调或丢失；2)抗原处理通路的改变导致无法将肿瘤特异性抗原递呈到T细胞；3)激活宿主免疫系统必需的共刺激分子或粘附分子的缺失；4)肿瘤局部的细胞因子缺乏或肿瘤细胞分泌免疫抑制因子；5)肿瘤抗原丢失或抗原调变等。多种因素的共存导致机体处于一种局部免疫抑制状态，使机体的免疫效应细胞不能产生有效的抗肿瘤免疫应答。针对肿瘤免疫逃避的机制，用转基因手段，将目的基因导入靶细胞中，提高机体抗肿瘤免疫反应，这种治疗手段称为肿瘤免疫基因治疗。 抗肿瘤瘤苗是肿瘤免疫基因治疗的主要策略，在瘤苗制备过程中对自体或异体肿瘤细胞进行表面修饰以增强其免疫原性和免疫效能，目前瘤苗修饰主要通过基因转染手段实现。如Hodge等将B7.1基因导入肿瘤细胞中表达，提供共刺激因子，能增强瘤苗的抗肿瘤免疫反应；Shrayer等用SEA基因转染小鼠B16黑色素瘤细胞，使之表达SEA，应用该瘤细胞制成瘤苗，显示了较强的抗肿瘤作用。 虽然基因转染法在肿瘤免疫基因治疗上起着很重要作用，但是基因转染法亦有其局限性，如原代细胞不易转染，转染效率低、整合后基因的降解及其表达的不稳定性以及制备费时和临床应用困难。因此有必要探寻适合于原代细胞转染、转染效率高、制备简便、临床易推广应用的转染法。 通过基因工程手段将糖基化磷脂酰肌醇(GPI)或蛋白质的跨膜区(TM)与目的蛋白质嵌合表达，由此制备的目的蛋白质能够锚定到多种细胞膜上，这种不通过基因转染手段使目的蛋白在靶细胞膜上表达的方法叫蛋白转染法(protein transfer)。GPI锚定蛋白转染法和跨膜区锚定蛋白转染法是目前常用的蛋白转染法。 GPI锚定蛋白转染法是指将目的蛋白编码序列和GPI锚定信号肽编码序列重组，制备该目的蛋白的GPI重组衍生物，当它在适宜的温度下与靶细胞共同孵育时，可整合至细胞表面并表达活性。Mchugh等将hB7-1基因胞外区与CD16B的GPI锚定信号肽基因序列融合，表达出hB7.1-GPI蛋白，该蛋白能嵌入细胞膜，其瘤苗能激活T细胞，并刺激其增殖，在体内和体外显示出较强的抗肿瘤作用。 浙汀人学博卜学位论义 易小勇 Brunschwig等将mB7工基因胞外区与DAFpGPIf定信号肽基因序歹融合，表 达mB7－GPI，该蛋白能嵌入细胞膜，实验发现它能提供T细她增殖的共刺激信 号。 1982年Boeke等首次提出将分泌型蛋白基因序列与跨膜型蛋白的跨膜区基 因序列拼接成融合基因，可将分泌型蛋白表达成跨膜型蛋白。1995年Chen等通 过基因工程方法，将细菌的分泌型碱性磷酸酶转换为跨膜型的碱性磷酸酶。此方 法称为跨膜区锚定蛋白转染法。WahLsten等将癌基因CerbB－2的跨膜区编码序 列与TSSTI编码序列融合，在细菌中表达，得到融合蛋白TSSTI－TM，它能锚 定在儿种瘤细胞表而，其痈茁有较强的抗亲本肿痫作用。马文学等将癌基因 Cerb－B－2的跨吸区编码序列与超抗原SEA编码序列融合，在细菌中表达，得到 触合蛋肉SBA－＊M，它能伽定在痫别胞茨而，其痢冰在体内外均显示出较强的抗 肿概作用。 蛋白转染法有许多优点：（1）不依赖于细胞自身增殖潜能及可转染性，故可 用于多利。原代细胞的转染，与细胞的类型和组织器官的来源无关：（2）在同一细 胞中复合基因的共转染及协同表达还存在一定的困难，而蛋白转染可允许多种蛋 向同时或顺序地锚定在细胞表而，适合于多下免疫分了吸表而修饰痢m的制趴 （3）在体外，可皿过基因工程方法大量制备用于蛋白转染的免疫分子，这些免 疫分子与病人自体肿瘤细胞共同孵育后，可较简便地制备经免疫分子表而修饰的 自体肿瘤细胞的瘤苗，无需在自体肿瘤细胞中作个别化的基因转染，因此有较大 的临床应用潜力。 JI。I’俯的免疫抑制Z时］Z涉及到多种兔疫活性冈了的下调，研究表明多摧因共转 染痫苗在打破肿瘤微环境的免疫抑制、激发机体的免疫应方而优于单基因转染瘤 芮，们多从闪人转染撇作复卉、＿巳筛巡多个从闪均高没达的州性克隆困难。为此， 本课题设想通过蛋白转染法将多种免疫分子同时锚定到肿瘤细胞膜，制成瘤苗， 发挥抡疫协同作用，以期其疗效能优于单种免疫分子锚定的瘤茁。经文献检索， h6iJ还没有这方而的研究报道。我们选用 SEA－TM和 ruB7．卫－GPI二种免疫分子， 作为日的蛋白，共同修饰抗肿瘤瘤苗。 本研究口的为：通过蛋内转染法，将 SEA－TM和 mB7．l－GPI锚定于小鼠T 细胞淋巴瘤细胞（EL4人制备双重免疫分子绷胞膜表面修饰瘤苗，以此为模型， 观察双贡免疫分子表而修饰瘤苗制各的可行性和瘤苗对亲本肿瘤的治疗作用和 免疫保护作用。 本课题研究内容包括：（）构建 mB7lGPI的表达载体，制策其融合蛋白， 仲之邯定广Z EL－4 9抉纠【）jbN而，制成二B7．l－GPI）JQ表mi修饰瘤苗：（2）将 SEA－TM 锚定在 EL－4瘤圳月b表而，制成 SEA－TM膜表面修