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黄芪对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2活性的影响及其作用机制

黄进宇  
【摘要】: 经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)是治疗冠心病的有效手段之一,其在临床的应用显著降低了冠心病事件的发生率和死亡率,使该类患者院内救治成功率大大提高,但术后六个月内再狭窄的发生率高达30%-50%,这严重影响了治疗的远期疗效。许多学者致力于防治再狭窄的基础和临床研究,但到目前为止尚未取得明显进展。再狭窄的发生机制目前尚未十分清楚,但近年来的研究普遍认为PTCA术后,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在中层增殖并通过细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解迁移至内膜而形成新生内膜是再狭窄发生的重要机理之一。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是近年来发现的一类Zn~(2+)依赖性并以ECM成分为水解底物的内肽酶所组成的蛋白酶超家族,研究发现MMPs与ECM降解及VSMC增殖和迁移有着密切关系,在再狭窄的发生、发展过程中起重要作用。目前中药 浙江大学博士学位论文 对VSMC分泌MMP活性的调节作用尚未见报导。本实验以培养的SD大鼠VSMC为研究对 象,观察了中药黄茂对大鼠VSMC e的MMP-2活性的影响并探讨其可能的作用机理。 第一部分 黄蔑对血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋自酶毛活性的影响 研究目的:佣u观察黄蔑注射液对培养的SD大鼠VSMC分泌的MMP-二活性的抑制作用 及对细胞培养液上清中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)水平的作用,并了解是否存在 量效和时效关系。 方 法:组织贴块法培养SD大鼠VSMC;兔疫组化染色法鉴定VSMC;Zymography检 测VSMC分泌的MMP-2活性;硝酸还原酶法测定细胞培养液上清中NO水平。所 有培养液均含 0.4InM L精氨酸。每组 nL。 结 果:在一氧化氮合成前体一L-精氨酸存在的情况下,0.snd,5 t,50mp/Inl的黄 蔑注射液分别刺激 VSMC 24h,VSMC的 MMP-2活性分别为 sl.75土6.40%,67.00土 11.75%,52.75ill.18%,与对照组(100%)比较显著升高(P<0.05,n=4),细胞培养 上清中的NO浓度u为sl.82土13.19 p、120.57土29.85…叽几、185.46士37.23 …叽几,较对照组(15.32士4.38 IJMILlJMIL)明显升高汐<0.05,11=4);黄蔑注射液 5仰卯M 分别刺激VSMC 0,6,12,24h后,VSMC的 MMP-2活性分别为 96.sl士5.31%,78.78土 6.56%,74.13土5.39%,66.00士6.07%,与对照组各相应时点 MMP-2活性(100%,96.78 f4.78%,97.59i4.54%,103.po士3.36%)相比较,除刺激即刻无显著差异外 ( cd.05, n=4),余均较对照组明显下降(P<O.05,n叫;细胞培养上清中的*O浓度分别为14.28 13.69 p、36.72士6.94 p、69。6319.54 p、125.6ill4.sl p,与对照 组各相应时点门.93土4.02…脱、12.66士5.41 w、14.25士5.87 w、12.90土 3.31 p)相比较,除刺激即刻无显著差异外(P >(刀5,n=4),余均较对照组明显升 高(P<O刀5刀二斗)。 2 浙江大学博土学位论文 结 论:黄茂注射液在体外抑制SD大鼠VSMC分泌MMP-2的活性,且此作用呈药物 浓度和时间依赖;黄蔑注射液刺激VSMC后,培养液上清中的NO水平明显上升, 此作用也呈药物浓度和时间依赖。 第二部分 黄芙对血管平滑肌细胞分泌基质金属 蛋白酶工活性影响的作用机制 研究目的:进一步观察NO在黄蔑注射液抑制SD大鼠VSMC N的MMP-2活性中的作 用,并探讨可能的机制。 方 法:体外培养SD大鼠VSMC,Zylllography检测VSMC分泌的MMP-2活性;Western 印迹杂交法检测 MMP-2及诱导型一氧化氮合酶(WOS)蛋白表达;RT-PCR检测 MMP-ZW表达。无血清培养 24小时后,VSMC继续以 10%FBS DMEM培养, 并分成 4组(n=4):A组:对照组;B组:0.SIYI..m.ru--氨基肌 C组:sgh黄茂注 射液;D组:swt黄蔑注射液+0.5111.si----氨基肌。各组继续培养24小时,所有 培养液均含 0.4InM e精氨酸。 结 果:B组 MMP-2活性为 105.2514.19%,略高于 A组(100%),但无统计学差异( >0刀5,n =4=4),C组MMP-2活性(62.75土8.88%)显著高于A组(P<0.01,n=勺,D组 MMP-2活性(82.00土 5.60%)较 C组增高(<0.of,if=4),但仍明显低于对照组(P <0.of,if=4)。B组的 MMP-2蛋白表达为 105.73f41.9%,略高于 A组(100%),但无 统计学差异(>0.05,if=4),C组 MMP-2蛋白表达(60.34 f 7.09%)显著高于 A组(P <0.0且刀叫,D组MMP-2蛋白表达门正*6土8.59%)较C组增高(P<0.0回,n=4),但仍 明显低于对照组(<0.


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