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幽门螺杆菌rdxA基因和外膜蛋白在甲硝唑耐药中的作用

周刚  
【摘要】: 幽门螺杆菌(Hp)是消化性溃疡的主要病因,是胃癌及原发性胃淋巴瘤的危险因素。目前,Hp的耐药问题正日益突出,已成为根治失败的主要原因之一。甲硝唑Hp感染首次成功治疗的重要成分,也是新三联,四联治疗的主要成分。但甲硝唑的联合治疗也可能由于耐药的产生而受到限制。 临床上幽门螺杆菌的分离,培养是较困难而复杂的工作,从而导致Hp的药敏试验很难在临床广泛开展。有必要深入了解Hp的耐药机制,在此基础上运用分子生物学的方法进行药敏试验,指导临床用药。同时也能为耐药性逆转提供基础。 目前Hp对克拉霉素等药物的耐药机制已基本明确,关于Hp对甲硝唑耐药机制的观点很多。较多学者认为与rdxA基因的突变有关。RdxA基因约630bp长,编码氧不敏感NADPH硝基还原酶(rdxA),其作用是把甲硝唑的NO基团还原成羟胺衍生物,还原物造成细胞DNA的损伤、断裂、解旋,进而引起细胞的死亡。rdxA基因发生突变会导致蛋白翻译过程提前终止,从而使硝基还原酶失活。但在实验中,也一直没有发现特定的核苷酸序列与Hp耐药表型有关,而在甲硝唑敏感菌株中也存在rdxA基因突变。在国内,尚无对该基因研究的报导。 而甲硝唑是1-(2-羧基)-2-甲基-5-硝基类药物,为一疏水性药物,需通过膜蛋白转运进入细胞内。戴宁等发现维拉帕米能通过抑制外排而在一定程度上逆转Hp甲硝唑耐药,提示膜耐药存在。但至今尚为发现、分离相关的膜耐药蛋白。 本文分离国内Hp临床菌株,进行耐药,敏感Hp rdxA基因的克隆,测序,并同Hp26695,J99及国外报导的菌株进行序列比较。并在此基础上选用无rdxA基因移码突变的敏感、耐药菌株,提取外膜蛋白,制备甲硝唑人工抗原、甲硝唑多克隆抗体,并用Wester Blot方法比较了敏感、耐药菌株中能与甲硝唑结合的外膜蛋白。 实验方法 1.菌株来源 所有Hp菌株均分离自胃粘膜活检标本。Hp标准参考株为NCTC11637。病 浙江大学硕士学位论文 人胃粘膜组织匀浆后接种于含10%羊血的哥伦比亚琼脂平板上,在微需氧环境中37oC培养 3—sd。 2.药敏试验 纸片扩散法初筛、二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝吧的耐药性。抑菌圈 直径<7 mm、最小抑菌浓度(MIC)38p旮1判为甲硝哩耐药株。 3.DNA制备 采用常规的苯酚一氯仿法。 4.PCR 引物序列:上游 了-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3’,下游5’- ***6*口***C*********丁3’。**R反应总体积为100“ 内含:25*。I几各 dNTP、250 nmoffe各引物、15 mol[L MgCI。、2.SU T叫酶、100 ng DNA模板、IXPCR缓 冲液(pHS.3)。PCR反应参数:94oC5min,XI 94OC305,50OC305,72t60s,X10; 94OC305,50’C305,72t70s(以后每循环增加 10s),X20:72“C10min,XI。 S.T-A克隆及测序 将扩增的目的片段克隆至 pUCm-T载体中,转化于 E.colt DH 5 a株 并扩增,用碱变性法提取质粒,经限制性内切酶(BamH,EcoR)酶切鉴定后委托 BBST公司测定插入片段的核苔酸序列。 6.测序结果分析 采用 DNA Tool*分子生物学软件分析上述临床菌株rdxA基因的核昔 酸和氨基酸序列,并与国外报道的 Hp 26695株(NC-0009]5)及门 株Hp rdxA基因序列 进行比较。 7.茵株涉择 选用己行药敏试验及 rdx A基因克隆、测序,无 rdxA基因碱基插入、缺失 的菌株。 8.外膜蛋白提取 收集并洗涤培养后的 HP,用超声细胞破碎仪破碎,1000 X n 20min, 去除没未破碎的细胞,加入蛋白酶抑制剂、RNA酶、DNA酶,超速离心 100000Xr for,去 上清,沉淀用肌氨酸溶解、悬浮,再超速离心 40000 X r 0.shr,去上清,沉淀用去离子水 溶解、悬浮。 9.甲硝陛多克隆抗体制备 9.1.全抗原MTZ--BSA制各 用碳二亚胺法制备牛血清白蛋白与甲硝哇交联物。 9.2.抗体制备用昭个WZ免役家兔6周,心脏采血,分离血清。用田A预处理组做对 照,行双扩法鉴定是否有抗体产生,并初步判断抗体效价。 10.甲硝陛结合外膜蛋白比较:甲硝哇溶液甲硝陛溶液与敏感、耐药菌的外膜蛋白溶液均 匀混合,4℃过夜。以甲硝哇多克隆抗体为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG 为二抗,用 Western blot检测能与甲硝哇结合的敏感、耐药幽门螺杆菌。 结 果 二药敏试验 临床分离的 ZI株 Hp(14株来自溃疡病患者,6株来自慢性胃炎患者,1株 来自胃癌患者)中,16株的MIC38Pg/ffil,耐药率为76.l%。 3 浙江大学硕士学位论文 2 PCR 8株不同 MIC的 Hp临床菌株 rdxA基因扩增片段约为 880hP,HP标准参考株 NCTC 637的rdxA基因扩增片段约为680hp。 3 Hp临床苗株 rdxA基因序列分析 8株Hp临床菌株 rdxA基因扩增产物的核昔酸和氨基 酸序列与 Hp 26695株比较,其核昔酸序列同源性为 90.IW95.l%。 4甲硝哇耐药性与rd


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