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单侧输尿管梗阻后大鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶的表达及其意义

秦杰  
【摘要】: 前言 尿路梗阻性病变在泌尿外科疾病中占有很重要的地位。泌尿系统的很多疾病在其发展过程中均可能出现尿路梗阻问题,如泌尿系统结石、肿瘤、结核和损伤等。引起尿路梗阻的原因很多,病变部位也不同,但最终均可出现肾积水及肾功能受损。根据Bell(1946)的一组统计,59064例尸检中,肾积水占3.1%,尤其近几年随着人口逐步老龄化,其发病率更有逐年增高的趋势。因此进一步认识本病的发病机制,掌握有效的治疗方法,延缓疾病进展的措施己越来越受到高度重视。研究尿路梗阻后肾脏变化的常用模型为单侧输尿管梗阻(UUO)模型,目前,国内对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在UUO大鼠肾脏的表达情况研究很少。本研究旨在观察iNOS在UUO大鼠肾脏的表达及意义。 材料与方法一、研究对象1.实验动物 雄性健康Sprague-Dawley大鼠(由浙江省医学科学院动物中 浙江大学硕士学位论文一中文摘要 心提供)36只,体重25D士20克。 2.动物模型及分组 制备左侧输尿管梗阻模型组(UUO组,30只),分术后 4小时,12小时,24小时,3天和 7天 5个处死组各 6只,同时设假手 术组*组,6只)作为对照组。动物模型参考国外 HoChber/大鼠以乙 醚吸入麻醉,腹部正中切日,双重结扎左侧输尿管,缝合腹壁。假手术 组未结扎左侧输尿管,其他操作同前。所有动物均给予常规饮食和饮水。 分别于术后 4小时,12小时,24小时,3天和 7天处死大鼠,取出梗阻 肾脏。部分肾组织用液氮保存,后转入一86OC冰箱保存;其余以10%中性 甲醛固定,制成石蜡切片,以备兔疫组化和常规染色用。 二、盯-KR检测: 1.引物序列:GAPDH上游引物为:5’-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3’, 下游引物为:5’-GGT GGT GAA GAC GCC AGT AG-3’,扩增长度为 305hP。 iNOS上游引物为;5’-GGA GGA GCT GAT GGA GTA GTA GCG G-3”下游 引物为:5’-叮AnT从CKG%A肛A“‘1 “O3’.扩增长度为 442hP。 2.实验方法:将50mg一100mg冻存组织在液氮中碾磨成粉末,加入lml TAIZOI试剂提取组织总RNA。取RNA 3fig用于逆转录,PCR反应条 件为:94度预变性4min,然后32个循环的扩增,最后72度延伸10min. 每个循环包括94度变性455,57度退火455,72度延伸605。PCR产物经 1.5%琼脂糖电泳,通过凝胶成像系统读取目的电泳条带的密度扫描值, 将iNOS条带与GAPDH条带的比值作为iNOS的表达相对量。 三、兔疫组化检测 l.免疫组化法检测 iNOS在术侧肾脏中的表达:采用ENVISION(两步法), iNOS多克隆抗体(抗体稀释比 1:100门7 C 60min;加入 HRP标记的羊抗 鼠 IgG(Envisio 二抗),37OC目 育 60min; DAB显色。 2 浙江大学硕土学位论文一中文摘要 2免疫组化阳性结果判定标准:标准参考国内刘少青口]。阳性细胞为呈棕色 的阳性反应产物。在400倍光镜下观察,随机选5个视野,计数阳性细胞 数和总细胞数,计算出阳性细胞率,然后计分,无阳性细胞为阴性门分入 阳性细胞率在25%以下为弱阳性(2分),25%-50%为阳性(4分),50%以 上为强阳性(6分)。 四、统计学方法 数据以平均数士标准差(二士S)表示,均数间结果比较用方差分析。所 有资料均在SAS6.12软件下操作。HO.05定为统计学差异有显著性 结果 1,肾脏病理改变 肾脏的大体改变:UUO组梗阻侧肾脏重量增加,并出现不同程度肾 盏和肾盂扩张,随着梗阻时间的延长,扩张程度也明显。光镜改变:UUO 组梗阻侧肾脏的肾单位表现为集合管管腔贯张,上皮萎缩,越接近肾盂 侧(远侧肾小管)越明显,近曲小管改变轻微,而肾小球保持正常结构。 在炎细胞浸润方面,UUO组的梗阻侧肾脏与假手术组相比,UUO术后4h 梗阻侧肾脏未见明显的病理变化,id后见小血管周围有少量的炎细胞浸 润,第3d时炎细胞浸润增多,在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎 细胞浸润。第7d时炎细胞浸润增多并达到高峰,以单核巨噬细胞为主。 2.各组大鼠肾组织iNOSmRNA表达水平 经RT-PCR扩增后的川OS为442hP,内参照GAPDH为305hP。RT-PCR 的结果显示:与假手术组大鼠比较,单侧输尿管梗阻后仅4h大鼠梗阻侧 肾皮质中即可见iNOS的mRNA表达轻度增强,于第24h明显增强,第3d 达到高峰,以后大鼠梗阻侧肾皮质中iNOS的mRNA表达逐渐减弱,于第 7d 时最低。分析各组iNOS 与GAPDH 光密度比值发现,UUO术后 3 浙江大学硕士学位论文一中文摘要 4h,12h,24h,3d各组大鼠的光密度比值明显高于假手术组(HO二01),梗 阻第7d大鼠梗阻侧肾皮质iNOS的mRNA表达与假手术组大鼠肾脏比较, 其?


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