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乙烯受体基因LeETR1和LeETR2在番茄乙烯受体系统中的生理学功能定位

杨虎清  
【摘要】: 乙烯是调控植物生长发育的一种重要激素,植物内源乙烯的生物合成、信号转导和生物效应的调控研究一直是一个热门课题。现在乙烯生物合成的途径已经阐明,而乙烯信号转导的研究则方兴未艾,目前主要集中在模式植物拟南芥上。但拟南芥无法作为呼吸跃变型果实的成熟模型。 本文在克隆番茄乙烯受体基因LeETR1和LeETR2部分特异序列,将LeETR1和LeETR2部分特异序列反向导入番茄植株,获得这两个受体基因表达受到抑制的转基因番茄植株的基础上,从T1代转基因植株中筛选转基因纯合株系,研究了LeETR1和LeETR2的表达水平降低以后植株营养生长、形态建成、乙烯生理以及果实成熟特性与野生型番茄的差异。主要结果如下: 1、根据NPT-Ⅱ基因对卡那霉素的抗性,我们采用卡那霉素筛选转基因番茄(T1)植株获得了理想的结果。我们对T_1代番茄幼苗的根进行了GUS染色检测。结果表明在检测的T_1代番茄幼苗中,阳性率为73.5%,染色组织呈深蓝色,而阴性对照则不染色,但不同阳性植株根部GUS染色后的表现则有所不同,有的植株整个组织都呈蓝色,而有的植株只在根的部分区域呈蓝色斑点。 2、根据Npt-Ⅱ基因和转入反义基因的序列设计引物,利用PCR的方法从T1代番茄中筛选出阳性植株;研究了GUS基因在T1代花粉中的表达规律。结果发现纯合植株番茄的花粉在37℃下培养染色5h后GUS基因全都表达,杂合体番茄植株表达了GUS基因和非表达的比例为1:1,对照植株的花粉无论在37℃培养5h还是10h都不表达GUS基因。与PCP检测结果相互印证,证明这个方法能够快速、可靠地从T1植株中筛选出纯合株系。 3、以LeETR1和LeETR2 cDNA为探针,研究了转基因番茄植株和野生型番茄植株中LeETR1和LeETR2两个受体基因的表达水平。结果表明,转反义LeETR1番茄植株,LeETR1基因的表达水平与野生型番茄相比,受到了显著的抑制;LeETR2基因的表达也受到一定的影响;转反义LeETR2基因的番茄,LeETR2基因的表达明显减弱;而LeETR1基因的表达基本不受影响。 4、对转基因番茄和野生型番茄幼苗的三重反应研究表明,在正常空气条件下,LeETR2反义转基因番茄幼苗的苗高和根的长度低于野生型植株,表现出一种不完全的乙烯组成性反应。在乙烯诱导的条件下,转基因(LeETR2)番茄幼苗 仍表现出正常的三重反应,但与对照相比,转基因幼苗根的伸长受到了乙烯的强 烈抑制,根毛的生长被完全抑制。提示LeETRZ的反义抑制导致幼苗的乙烯敏感 性提高。 5、在正常生长条件下,LeETRZ反义转基因番茄植株和野生型的叶片都没有 表现出明显的偏上生长特性。当使用25p班的乙烯处理24h时,转基因植株没 有观察到明显的表型变化,而野生型植株则表现出强烈的偏上生长。说明转入反 义LeETRZ后枝叶对乙烯的敏感性下降。 6、L已ETIU反义转基因番茄叶柄和花外植体脱落速度显著低于野生型番茄。 乙烯能够促进脱落,但转基因(L eET况2)番茄外植体的脱落速度低于野生型植 株,说明LeETRZ的表达受到抑制以后,外植体对乙烯的敏感性下降。. 7、研究了LeETRZ反义转基因番茄外植体脱落区纤维素酶活性的变化规律。 用乙烯处理引起纤维素酶活性增加,但野生型材料的纤维素酶活性比转基因植株 (LeETRZ)增加的快,酶活性也高的多。表明野生型植株较快的脱落速度与较 高的纤维素酶活性有关系。正常情况下纤维素酶受乙烯诱导表达,表明LeET况2 的反义抑制也影响了纤维素酶的乙烯诱导机制。 8、研究了LeETRZ和LeETRZ反义转基因番茄果实的成熟特性。发现LeETRI 被反义抑制后,果实的成熟与衰老特性与对照番茄有明显的不同:(1)成熟推迟 (2)番茄红素的合成受到显著抑制,果实没有表现出正常的红色果皮(3)果实 推迟软化;而LeETRZ基因被反义抑制以后,果实的成熟没有受到显著的影响。 9、研究了番茄果实成熟过程中1一MCP处理对果实成熟的影响作用。结果表 明用1一MCP处理绿熟的番茄能够显著地抑制果实的着色、软化过程以及乙烯产 量。分析了1一MCP处理对番茄果实中受体基因表达的影响,发现在果实成熟过 程中1一MCP能够抑制NR基因的表达。 10、在番茄乙烯受体基因家族中,目前已经克隆了6个成员。综合他人及我 们自己的研究结果,推测在不同的组织中,这些受体基因可能具有多种调控模式; 在不同的受体之间不仅存在功能上的互补作用,还存在功能上的明确分工。我们 首次报道了玫ETRI在果实成熟调控中的明确功能;址ETRZ则作为基础乙烯受 体,在番茄的营养生长发育中起着多方面的作用。


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