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脱水蛋白和CBF1转录因子对植物抗旱性和抗冻性作用的研究

边红武  
【摘要】: 低温和干旱是影响植物生长、发育和地理分布的重要环境限制因素。低温和脱水诱导大量基因的表达,基因产物可分为两大类:一类是直接保护细胞免受胁迫伤害的功能蛋白;另一类是传递信号和调控基因表达的调节蛋白。本文以植物脱水蛋白和冷诱导转录因子CBF1基因为主要研究对象,探讨它们在低温和干旱胁迫中对植物抗冻性和抗旱性形成的作用。 一、脱水蛋白对植物抗冻性和抗旱性作用研究 以铁皮石斛类原球茎(PLBs)为材料,研究脱水、低温、高渗、高盐和外源ABA处理与诱导热稳定蛋白和脱水蛋白的关系,以及胁迫诱导蛋白的积累与各种抗逆性形成的相关性。主要实验结果如下: 1.用空气干燥法对PLBs进行脱水处理及超低温保存,分别测定不同含水量样品的冻前和冻后存活率,并进行可溶性糖含量测定、热稳定蛋白的SDS-PAGE分析及脱水蛋白的Western-blot检测。结果表明:在本实验体系下,PLBs脱水时间(x)对含水量(y)的回归方程式为y=-0.1208x+9.9636。PLBs含水量为0.1g至0.5H_2O/g DW时,其冻后存活率达到最大值。当含水量达1.0g H_2O/g DW时,电泳图上出现五条明显增强的热稳定蛋白条带,分子量分别为34.3、28.7、19.2、17.0、13.3kDa。经抗脱水蛋白免疫检测发现其中分子量为28.7和34.3kDa的蛋白为脱水蛋白。干燥处理中PLBs的可溶性糖含量增加,其积累主要发生在含水量大于7.2g H_2O/g DW的阶段。可见脱水蛋白的积累要早于糖的积累。外源ABA的预处理可明显提高可溶性糖、热稳定蛋白和脱水蛋白的含量。 2.低温驯化3天开始检测到28.7 kDa脱水蛋白的积累,随后其含量逐渐增加,驯化7天时含量最高。但是驯化过程中,热稳定蛋白水平并无明显变化。经低温驯化PLBs的抗冻性比未经驯化的对照明显提高。在-8.2~-8.0℃温度下冰冻2小时,对照的相对存活率为2.6±0.7%,驯化3天和5天的PLBs具有较高的抗冻性,其冻后相对存活率分别为56.3±22.5%和49.9±19.5%。随着低温驯化时间延长至7天,PLBs的冻后存活率并未进一步上升,为31.4±14.7%。 3.通过对不同浓度PEG和NaCl处理后PLBs存活率的测定,得出PLBs的PEG半致死浓度为40%、NaCl半致死浓度为200mmol/L。PEG处理诱导17.0kDa热稳定蛋白的积累,其含量随PEG浓度的增加而增加。而NaCl处理对热稳定蛋白影响不明显。经抗脱水蛋白免疫检测,发现PEG和NaCl处理均不能诱导PLBs脱水蛋白的积累。 二、转CBF1基因提高植物抗冻性和抗旱性研究 浙江大学博士学位论文 以烟草为材料进行了转CBFI基因研究,并对转基因后代开展了形态变异观 察、抗冻性和抗旱性测定以及遗传稳定性分析。主要结果如下: 1.将C丑尸z基因与Cal城v35s启动子融合构建植物表达载体pBnZI一CBFI, 以农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得转化植株。经C万卢7基因的PCR鉴定和 转基因后代(包括Tl、TZ和T3代)的卡那霉素抗性分析,获得2个单一位点 插入的转基因纯系,证明了外源基因在转基因烟草中的表达及遗传。 2.采用电解质渗漏检测和小苗冻害观察进行转基因后代的抗冻性检测,结果 显示C万卢了基因的表达有利于冰冻条件下细胞膜和叶绿体膜的稳定性,从而使转 基因烟草的抗冻性增强。 3.采用不同PEG处理浓度和处理时间对转基因后代进行了抗旱性测定,发现 可选用15%的PEG浓度处理48小时来测定小苗抗旱性。结果显示转基因烟草 的抗早性比野生型烟草增强。 4.转C万尸了基因烟草出现明显的表型变化,主要有植株矮化、花器官变异、 叶片卷曲或细长和果实数减少等。分析原因可能是与CBFI转录因子所具有的 AP2/ EREBP结构域的功能有关。注尸2基因是拟南芥花器官特征特异性基因,能 在各轮花器官及茎叶中表达,无组织特异性。推测C万尸了基因的组成性表达,干 扰了烟草原有的花器官和茎叶生长发育,导致转基因植株的表型改变。


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