大熊猫保护遗传学研究

【摘要】： 目前，大熊猫野生种群的数量约1000只左右，且仅分布于我国四川、陕西和甘肃三省之秦岭、岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山等六个彼此隔离的山系。多年来，有关大熊猫的研究，主要集中在生理学、生态学、生物化学、病理学、古生物学、形态学和分类学等领域，而针对该物种野生种群遗传背景方面的研究却极为鲜见。 近年来，保护遗传学基础研究与实践的结果表明，物种或亚种的起源、进化历史、种群间的基因流和种群遗传多样性等遗传背景的有关参数，是制定物种保护策略之最重要的科学依据之一。 小种群必然会导致近交的出现，并造成后代多态位点的丧失和种群纯合度的上升。基于此，寻找一种能有效检测种群遗传背景相关参数的遗传标记，是查明物种遗传背景的前提，而对种群大样本数的群体检测，则是衡量其遗传背景相关参数可信度的基础。 文献显示，线粒体DNA和微卫星标记，目前尚不能提供足量的遗传信息以满足于对大熊猫遗传背景的评价。因此，DNA指纹因可揭示物种基因组DNA的多态性而成为迄今开展大熊猫这一特殊物种保护遗传学研究的理想遗传标记。该标记可揭示影响物种的近期历史事件。 1975-1985年期间，大熊猫主食竹类开花，导致几百只大熊猫的死亡。这些死亡尸体，绝大多数通过福尔马林固定的方式予以保存。由于固定样品受交联作用的影响，使其高分子量的DNA难于提取和应用。 鉴于上述，作者以《大熊猫保护遗传学研究》为博士论文命题，开展了相关研究，并获得了如下结果： (1)虽然乙醇逐级脱水对于DNA的提取是极为重要的，但是，它不能完全祛除固定组织中的福尔马林，从而不能获得高分子量的DNA。为此，作者：①将原方法中80％-100％的乙醇逐级梯度脱水，改为30％-100％的梯度脱水，并增加了用醋酸异戊酯置换乙醇对样品进行临界点干燥，以达到完全祛除固定组织中福尔马林的目的；②经过银镜反应测试，证明了固定组织中的福尔马林已被完全祛除；③经脉冲场电泳检测表明，自经该方法处理的固定组织中提取的DNA，其分子量由原来的80-110kb，增加到了194-225kb；④经线粒体和核基因的PCR扩增，以及DNA指纹杂交验证，表 S加山es加C枷映邝西.G~i牌of山e场.峰P..如 明该方法提取的DNA，已完全解除了交联，可被完全酶切和进行DNA杂 交。该结果，不仅解决了大熊猫高质量DNA的来源问题，也解决了生命 科学、生物医学和法庭科学领域中固定组织DNA的利用问题。 (2)文献报道的大熊猫DNA指纹探针FZZGP矢心阅801，能检侧到36个位点的 遗传信息，也能准确地鉴别个体，阐明种群结构与遗传结构等问题。但是， 该探针不能检侧到大熊猫种群或物种的特征性条带，从而无法自保护遗传 学角度，提供种群分化的直接证据。基于此，本文研制了大熊猫的第二代 寡核昔酸指纹探针gPZooo。GP2000除了能准确地鉴别个体和阐明种群结 构与遗传结构外，其检侧的遗传信息位点己由原来的36个增加到了39个， 并检侧出了大熊猫的物种特征带和除秦岭种群以外的其余五个山系种群的 特征带。这些遗传信息，为客观地阐明大熊猫的进化历史，以及直观地反 映“瓶颈效应”和“奠基者效应”等问题，莫定了坚实的基础。 (3)两个大种群—峨山和邓蛛种群，有最高的遗传多样性。而最小的两个种 群—大相岭和小相岭种群，显示出最低的遗传变异能力，并存在着严重 的近交。秦岭种群虽然较峨山和邓睐种群小，且具有最少的条带数和最狭 窄的谱带分布范围，但却与氓山和邓蛛种群处于同一遗传多样性水平。该 结果说明，较少的条带和较狭窄的谱带分布范围，不能作为评价遗传多样 性的参数指标，但显示了种群具有较慢的进化历程。 (4)遗传多样性的分析结果表明，大熊猫的种群越大，栖息地片段化对其遗传 多样性的影响就越显著:大熊猫的种群越小，种群数量的减少对其遗传多 样性的影响也越显著。 (5) DNA指纹图谱，揭示了大熊猫六个山系具有包括早期隔离、中期分化和近 期遗传退化等三种不同的分化模式。大约10000年前的冰川作用，导致了 秦岭种群和其他种群在DNA指纹图和形态特征两方面，均出现了显著差 异。基于这两方面的显著差异，作者将秦岭种群定为大熊猫的一个新亚种， 即秦岭亚种(A.二qtnlini卯秘括)，而其余五个山系种群定为四川亚种(指 名亚种)(A.二川岭勿加扭姗)。因此，秦岭亚种应作为一个单独的保护单元 予以管理。在四川亚种中，五个山系种群应划分为两个保护单元进行管理， 即“峨山一邓峡”管理单元和“大相岭一小相岭一凉山”管理单元。 (6) DNA指纹图、酶切位点的错配分布、DNA中性检验和单倍型的最小空间网 络结构图综合显示:作为一个物种，大熊猫经历了两次瓶颈:①约24000 孕 S加击.皿C.场‘训币稠6.触石份成d姆肠翻吐P.山 年前的冰川事件，导致了大熊猫的第一个完全性瓶颈—不足10只的大 熊猫个体在秦岭山系存活下来;②约10000年前的冰川期，导致了大熊猫 的局部瓶颈，即第二个非完全性瓶颈—不足10只的大熊猫个体，幸