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抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究

徐飞虎  
【摘要】: 绿色荧光蛋白作为一种新型的标记分子,可应用于活体细胞的实时检测。目前已有相当多的文献报道关于将GFP基因与特定抗体或细胞因子基因结合进行融合表达的研究,证明融合蛋白具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能,可用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究,应用前景广阔。 目前国内关于将绿色荧光蛋白与其他细胞因子融合表达的报道较少。相关的报道有抗肝癌单链抗体融合GFP在真核细胞中的表达,以及重组IL-18-GFP融合蛋白活性研究等。本论文拟将抗肺癌单链抗体连接绿色荧光蛋白进行融合表达,预期目标蛋白应同时具有抗体活性及光激发绿色荧光双重功能。 本实验经PCR方法从mRNA逆转录产物中克隆到抗肺癌抗体的重链可变区和轻链可变区,并利用重叠延伸PCR方法将其构建为单链抗体scfv形式。利用酶切连接将scfv基因序列插入到绿色荧光蛋白基因3’-端构成gfp-scfv重组基因,并转化大肠杆菌表达。经IPTG诱导表达后并SDS-PAGE蛋白电泳,与阴性菌对照,在预期分子量范围内出现一明显条带。利用Ni-NTA树脂纯化蛋白,出现两个明显的峰。SDS-PAGE电泳分析表明,其中一个峰的蛋白条带符合预期蛋白分子量。396nm激发显示绿色荧光,证实目的基因在宿主中得到表达。不过,表达出的蛋白是否具有抗体活性还需要进一步的分析研究。


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