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人骨髓间充质干细胞的分离、培养及向软骨细胞方向的诱导

邱丽燕  
【摘要】: 骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外,还含有产生非造血组织的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),骨髓MSCs由于具有以下特点而日益引起人们的兴趣:1.在不同的理化环境和细胞因子的诱导下,MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞甚至神经元样细胞等多种间充质细胞系;2.MSCs是造血支持细胞,作为滋养层支持造血干细胞的生长。由于具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点,骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景十分广阔。 但人们对MSCs本身的认识还远远不足。至今还未能筛选到MSCs特异性的标记分子,尚未能建立鉴定MSCs的统一标准,同时由于使用的血清的批号不同等原因,使得不同实验室的数据之间可比性较差。因此寻求MSCs的稳定培养条件还有待进一步的研究。本实验从骨髓中分离MSCs,体外培养扩增,观察MSCs的形态,检测不同培养基对MSCs生长的影响,测定生长曲线,利用流式细胞仪对培养的细胞进行表面标记的测定和细胞周期的分析,并体外诱导MSCs向软骨方向分化,检测软骨特有的Ⅱ型胶原mRNA的表达,从而了解MSCs的生物学性状,探索MSCs的生长条件。 我们利用密度为1.077g/ml的Ficoll分离液从人骨髓中分离MSCs,分离培养的间充质干细胞在原代和传代培养中其形态学上观察均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致。流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养的MSCs代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞纯度增加。第三代的MSCs大约有80%处于G_0/G_1期,S+G_2+M期约20%左右,说明MSCs有强大的增殖潜能。MSCs在传代培养中的最适接种密度约为5.0×10~3/cm~2左右。MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期三个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多。经过比较发现DMEM-LG培养基是最适合MSCs贴壁和增殖的培养基。采用程 浙江大学硕士学位论文 序降温法对MSCs进行冻存,60~90天后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍 可在体外良好生长4~6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的 细胞仍具有良好的增殖能力。对四例标本的前三代MSCs在体外利用TGF一pl和 维生素C诱导两周后,用RT一PCR证明MSCs表达软骨特异性的H型前胶原的mRNA, 说明我们培养的细胞具有向软骨细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs。 在体外MSCS成功地传代达7一10代左右。


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