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酵母培养制备(1→3)-β-D-葡聚糖方法及相关基础研究

王亚军  
【摘要】: 具有免疫活性的(1→3)-β-D-葡聚糖是葡萄糖通过(1→3)-β-D-糖苷键连接而成的一类高分子化合物,广泛分布在细菌、酵母、蘑菇、真菌、谷物、海藻中。Saccharomyces cerviseae是重要的一类单细胞真菌,外被一坚硬的刚性细胞壁包围,(1→3)-β-D-葡聚糖是构成细胞壁的主要组分之一。(1→3)-β-D-葡聚糖通过与巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞上的受体相互作用,诱导生物活性,提高宿主免疫功能,具有抗肿瘤和辐射保护作用,是哺乳动物、无脊椎动物的免疫促进物,还可用于治疗细菌、病毒、真菌和寄生虫引发的疾病。 S.cerevisiae FL1因具有较厚的细胞壁而被选择为(1→3)-β-D-葡聚糖的生产菌株。在液体YEPD培养基的生长,S.cerevisiae FL1最大比生长速率μ_(max)0.51h~(-1),细胞倍增时间约1.34h。在利用单因素摇瓶实验考察营养和环境条件对S.cerevisiae FL1生物量影响的基础上,得到了较优的培养条件:8%(w/v)葡萄糖,4%(w/v)蛋白胨,1%(w/v)酵母浸提物,培养温度30℃,种龄5~8h,接种量2~4%(v/v),摇床转速220r/min,装液量30%(v/v)。随后,考虑到单因素试验设计的局限性,采用了响应面法对发酵培养基进行了优化。响应面法系数学与统计学的结合,它有助于快速建模、缩短优化时间和提高工程应用可信度。通过响应面法建立了S.cerevisiae FL1生物量与培养基组分蔗糖、硫酸铵及酵母浸出物浓度之间的函数关系 y=9.8634+1.0066x_1-0.2782x_2+2.3718x_3+0.3187x_1x_2+1.1812x_1x_3-0.1688x_2x_3,-0.2414x_1~2-0.0735x_2~2-1.0191x_3~2 其中,x_1、x_2、x_3分别表示蔗糖、硫酸铵和酵母浸出物的编码值浓度。该模型与实际符合程度较高(R~2=0.997)。变量分析揭示,在考察范围内,酵母浸出物对生物量收率影响程度最高,蔗糖次之,硫酸铵最弱。优化得到的发酵培养基为:115.5g/L蔗糖,10.0g/L硫酸铵,25.0g/L酵母浸出物,0.1g/L NaCl,0.1/LCaCl_2·2H_2O,0.5g/L MgSO_4·7H_2O,1.0/L KH_2SO_4。上罐发酵,S.cerevisiae FL1的最大生物量42.96g/L。 传统的(1→3)-β-D-葡聚糖制备方法是基于酸碱反复萃取,这种方法的明显不足在于酸、碱试剂用量大、产物杂质含量高、劳动强度大和环境污染大。本工作提出了使用次氯酸钠氧化S.cerevisiae FL1自溶细胞制备(1→3)-β-D-葡聚糖的思路。在考察了各种理化因素对细胞自溶率的影响后发现,52℃下,S.cerevisiae FL1暴露在1.5%(v/v)乙酸乙酯(pH5.5)溶液中,S.cerevisiae FL1自溶率达到最值。自溶36h后,自溶进行得比较彻底。而且与平衡期的S.cerevisiaeFL1细胞壁相比较,自溶细胞的细胞壁基本保持不变。利用自溶过程降解、去 浙江大学博士学位论文 除细胞内的大分子物质,继而使用稀次氯酸钠溶液氧化5. cerevisia。FLI自溶细 胞制备真菌(l一3)一p一D一葡聚糖。借助于元素分析、红外吸收光谱技术和‘H NMR,得到的多糖系(l峥3)一p一D一葡聚糖。(1分3)一p一D一葡聚糖’H NMR谱图分 辨率与温度相关,温度越高,谱图分辨率提高;(1分3)一p一D·葡聚糖的水溶性较 差。 细胞在其自然栖息环境和工业培养过程如食品、制药工业、绿色化学合成、 深海微生物学和有机相生物转化以及细胞固定化工程中,常常要忍受高盐、高 糖渗透应激作用。为了揭示渗透作用机制,考察了氯化钠、山梨醇、甘油和聚 乙二醇(PEG600)等4种化合物对模式生物5. cerevisiae细胞生长、形态结构 和代谢的影响。24h细胞培养结果表明,渗透抑制作用随着渗透强度的增加一 致加剧,抑制细胞比生长速率。当甘油浓度上升到4.52 mol/L时,细胞增殖完 全被抑制。增加环境中甘油浓度能增加细胞平均体积,并随着甘油浓度的提高, L:B值趋近于1.18左右,细胞形状趋于球形,这减少了细胞的比表面积,有利 于减少胞内水分的损失流量,从而保护了细胞。在生理可接受的渗透强度内, 与对照组相比较,0.5 mo比氯化钠和0.33m。比PEG600不影响最终残糖水平 和生物量浓度。5 cerevisiae FLI由于具有刚性的细胞壁能耐受低渗应激处理, 尝试通过了低渗应激诱导5. cerevisiaeFLI合成(l峥3)一p一D一葡聚糖。与对照组, 等渗环境的5. cerevista。FLI相比,低渗环境抑制了细胞壁的增长,但低渗、等 渗交替作用对细胞壁的效应最明显。低渗应激处理40h后,细胞p一葡聚糖含量 7.2%,而低渗、等渗交替作用40h后,细胞壁p一葡聚含量提高了18.1%。低渗、 等渗交替作用能够刺激5. cerevisiaoFLI合成(1分3)一p一D一葡聚糖。 通过简化5. cerevisiaeFLI菌落形态和引入未饱和系数、渗透作用,得到了 一个描述不同渗透环境下5. cerevisiae FLI在YEPD固体培养基上的增殖模型 m(t) 0 .00004lx0.006728 加.000041“+(0.006728“一0.000041”)。一,聆 其中,刀表示环境因子 的效应。卢越大,环境越利于细胞的增殖,环境越友好;Z为适小,环境越不利于 细胞的增殖,环境越恶劣。使用该模型,我们建立了一个定量描述不同渗透剂 在不同浓度时的渗透抑制作用。对照组YEPD平板、o.smol几氯化钠、0.巧mol几 甘油、o.smol/L氯化钠和。,15mol几甘油


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