微生物法还原羰基化合物制备手性药物中间体的研究

【摘要】： 近年来，随着对不同光学异构体药物药理作用研究的进展及对消旋药物申报和使用的种种限制，手性药物的研究和开发已经成为国际新药研究的热点和方向。由此而来的手性化合物合成方法就成了手性药物能不能商品化生产的关键。许多研究者都在致力于研究和开发产物转化率高、手性选择性好的手性化合物合成路线，其中生物转化法由于其温和的反应条件及高度的手性选择性而受到人们的青睐。 氯代苯乙酮是许多重要手性药物的先导化合物，文献中已经有了采用微生物法立体选择性地还原羰基化合物制备各种手性醇的报道，本文将对微生物法还原氯代苯乙酮类化合物制备手性氯代苯乙醇进行系统深入的研究。 现有的有机化学品市场没有本文所研究的手性或消旋的氯代苯乙醇供应，为此必须自行合成氯代苯乙醇作为研究工作的标准品。在实验室条件下采用化学法还原2’-氯-苯乙酮，3’-氯-苯乙酮和4’-氯-苯乙酮，制备出了外消旋的2’-氯-1-苯乙醇，3’-氯-1-苯乙醇和4’-氯-1-苯乙醇。经分离提纯后获得的产物醇纯度达到了99％以上，同时，对外消旋化合物中两种手性异构体的分析方法进行了研究，通过对手性柱的选择和气相色谱条件的优化，使两种对映体得到了良好的分离，为研究工作的顺利开展创造了条件。 从十一株实验室保藏的酵母菌株中筛选出了四株对氯代苯乙酮具有不对称还原能力的菌株，包括两株酿酒酵母S.cerevisiae P2及S.cerevisiae B5和两株假丝酵母C.pseudotropicalis 104及C.utilis 1257，其中以S.cerevisiae B5的还原效果最佳，还原产物不但有较高的产率，而且有很好的立体选择性。在2’-氯-苯乙酮，3’-氯-苯乙酮，4’-氯-苯乙酮和3-氯-1-苯丙酮等一系列底物中，S.cerevisiae B5对2’-氯-苯乙酮的还原效果最好。 深入研究了S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮制备R-2’-氯-1-苯乙醇的过程。研究结果标明，产物R-2’-氯-1-苯乙醇的对映体过剩值可达到100％。考察了甲醇，乙醇，2-丙醇，正丁醇，葡萄糖，甘油和乳酸等辅助底物对还原产物产率和手性选择性的影响，确定了最佳辅助底物为乙醇，最佳浓度为5％。乙醇的功能是在醇脱氢酶的催化下实现辅酶Ⅰ(NADH)的原位再生并用于补充底物还原反应中NADH的消耗。对S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮制备R-2’-氯-1-苯乙醇的反应条件进行了优化，当反应时间为24小时pH为8.0及反应温度为25℃时产物的产率最高。研究了底物 浙江大学博士学位论文 摘要 浓度、酵母细胞用量及酵母培养条件和还原反应条件对反应产率和立体选择性的影 响，发现底物对生物还原反应有抑制作用，增加酵母用量可提高产物的产率，好氧条 件下培养酵母并在好氧条件下进行生物还原也有利于提高产物的产率。采用分批加入 底物的方法能减轻底物抑制作用，提高转化率。同时还研究了重复利用5. cerevisia。BS 细胞用于生物还原，发现酵母细胞重复利用巧次后仍有一定的生物活性。 实验研究了S。。revisiae BS和C Pseudot尸opicalis 104还原3一氯一1一苯丙酮制备R一3- 氯一1一苯丙醇的过程。s.。erevisi“。BS和c Psoudo介’oP icalis 104还原3一氯一1·苯丙酮合 成R一3一氯一1一苯丙醇的对映体过剩值均达到100%，两者的产物产率类似，都能达到约 50%。研究发现最佳辅助底物也是5%的乙醇，5. cerevisia。BS和cPsoudot了’oP icali，104 还原3一氯一1一苯丙酮的最佳反应时间均为24小时，最佳pH均为pH6.0，最适温度分 别为25℃和30℃。分别考察了底物浓度、酵母细胞加入量、酵母细胞培养条件和还 原反应条件对反应产率和立体选择性的影响。考察了分批加入底物对还原效果的影 “向。 深入研究了在乙醇存在卜生物还原过程中酵母细胞内NADH、NAD十、NADPH 及NADP一于浓度的变化规律，发现胞内NADPH浓度迅速降低到零，而NADH浓度始 终维持在较高水平，证明了用于底物还原反应的辅酶是NADH，辅助底物乙醇的加 入有利于实现辅酶I(NADH)的原位再生。推导得到了包括辅酶的双底物顺序酶催 化反应机理的数学模型，针对S.。erevisia召BS催化还原2’一氯一苯乙酮的反应过程，从 实验数据回归得到了模型参数。 动力学参数为: 珠l二8 .0只20一moL几·h，KmB、=9.0火20“4 moL几，Ks人l二2.0火10一6 moL几 动力学方程为: 8火1尹[2，一chl二oaeetoPhenone〕〔NADH〕 V; . 二一 9又10一‘[N肋H卜9只一。一4火2火20一6+[2，一。hz。roaeetophenone」[NADH〕 将上述模型用于实验数据时，计算曲线与实验数据能很好地吻合，说明这一过程符合 顺序反应机制。 考察了水/有机相两相体系中5.cerevisl’a。BS对2’一氯一苯乙酮的还原情况。在所研 究的有机溶剂中，发现十二烷为最佳有机溶剂，产物产率比水相中反应提高了10.8 浙江大学博士学位论文 摘要 倍。进一步对5. cerevisiaeBS的还原活性与有机溶剂的疏水性(LogPot。)进行了相关 性分析。对水/十二烷两相体系中十二烷的含量对还原活力倍数的影响进行了探讨。