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重组大肠杆菌高效生产可溶性的人β防御素

王芳  
【摘要】: 人β防御素-2(HBD-2)是一种由41个氨基酸组成并富含半胱氨酸残基的阳离子抗菌短肽,内有三个二硫键。它具有广泛的抗菌谱,尤其对革兰氏阴性菌和酵母有很强的杀伤作用;而且致病微生物不会对它产生耐药性,因此有很好的药用前景。本文的目的在于实现HBD-2在大肠杆菌内的高效表达,研究内容包括重组表达体系的构建和筛选,发酵条件的优化及放大,抗菌活性的初步检测,以及同族的HBD-3和HBD-4的重组表达。 首先基于pET-28a(+)、pQE30、pBV220、pGEX-4T-2、pET-32a(+)、pMAL-p2表达系统,以经过密码子优化的HBD-2前体编码序列(shBD2)及其重复序列作为目的基因,构建了一系列表达载体。通过对产物的表达水平和可溶性的比较,确定携带TRX作为载体蛋白的pET32-shBD2为最适的表达载体。针对不同拷贝数shBD2基因表达水平的差异,考察了重复序列对于菌体生长和质粒稳定性的影响,发现含较少拷贝数shBD2基因的重组菌在生长和质粒稳定性上有明显优势,而且培养基中添加葡萄糖可以改善携带较多shBD2基因的重组菌的生长状况和质粒的不稳定性。另外,对不同来源的hBD2基因用pET-32a(+)系统的表达比较证明了密码子的优化可以有效提高HBD-2在大肠杆菌中的表达水平。 随后对重组菌E.coli BL2l(DE3)/pET32-shBD2的摇瓶发酵条件进行了优化。通过三种培养基的对比实验,确定MBL为最适培养基。实验结果表明降低培养温度可以显著提高目的蛋白的可溶性,发酵温度为28℃时目的蛋白可溶表达效果和发酵时间长度最佳。最适摇瓶装液量为12%(v/v)。诱导条件对HBD-2融合蛋白的表达有重要影响,对数生长中期为最适的诱导时间,诱导剂IPTG的最适浓度为0.8mM,诱导后表达8hr终止发酵。在最适条件下发酵所得可溶目的蛋白溶解性高达92.3%,产量达到1.3g/L。在摇瓶发酵研究的基础上,成功实现了在10L发酵罐上的发酵。 得到有生物活性的产物是进行HBD-2重组表达研究的最终目的。对表达的融合蛋白纯化并切割后收集的重组HBD-2进行了抑菌检测,初步确定了HBD-2重组表达产物对敏感菌E.coli K12 D31有明显抑菌活性。 人β防御素-3(HBD-3)和人β防御素-4(HBD-4)与HBD-2同属人β防御素家族。在成功实现HBD-2的大肠杆菌表达的基础上,用经密码子优化的HBD-3和HBD-4成熟肽编码序列作为目的基因,构建了表达载体pET32-smhBD3和pET32-smhBD4,表达所得两目的蛋白分别占细胞总蛋白的33.6%和51.3%且溶解性高达90%。而且发现将HBD-2成熟肽与载体蛋白TRX直接融合也可以实现其在37℃的高可溶性表达。


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