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鼻咽癌细胞株(CNE-2)中生长抑素受体亚型SSTR1~5mRNA的表达及奥曲肽对其生长抑制的研究

孙晓南  
【摘要】: 前言 生长抑素(somatostatin,SS)既是重要的垂体激素,也是一个有着广泛生物学活性的胃肠激素,它对许多生理活动有抑制作用。生长抑素作为一种抑制肽对各种分泌和增殖效应起调节作用。这种调节作用是通过与多种信号传导通路结合的G蛋白偶联受体家族(SSTR1-5)来介导的。5种受体表达于各种不同的正常和肿瘤细胞,每个受体的表达表现为受体的亚型和特有的细胞类型。不同的受体亚型,表现为生长抑素抗增殖效应独特的信号传导通路。 生长抑素作用于各种靶器官,包括脑、垂体、胰腺、消化道、肾上腺、甲状腺、肾脏和免疫系统等来调节不同的生理功能。这种作用包括抑制内分泌和外分泌、调节神经传导、运动和识别功能、抑制肠动力、营养物质和电 浙江大学硕士学位论文 解质的吸收、血管收缩和细胞增殖。 充分的证据已证明生长抑素可抑制各种正常和肿瘤细胞的生长。迄今, 已有许多体内和体外的试验提示生长抑素肤的类似物具有抗肿瘤活性。生长 抑素肤受体在大量不同的肿瘤中均有表达,然而,若将肿瘤中存在的生长抑 素受体用于诊断和治疗需根据肿瘤中所表达的每一个受体亚型的抗分泌和抗 增殖的生理作用来决定。 肿瘤组织或细胞株上存在55受体。目前已证明非神经内分泌肿瘤组织 内SSTR水平低,并发现50%以上的乳腺癌、40%的结直肠癌SSTR为阳性, SSTR也存在于淋巴瘤、前列腺癌、肺癌等肿瘤及转移灶。新加坡国立大学 医院的Loh KS首次报道了对12例鼻咽癌患者活检标本利用放射自显影检测 ssTRs的结果。发现有中到高的ssTR一2表达。在鼻咽癌中检测到生长抑素 受体可能将会对该肿瘤的治疗有一定的帮助。 本实验在体外对鼻咽癌细胞系CNE一2进行研究,采用免疫组化方法和逆 转录一多聚酶链式反应(RT-PCR)检测其SSTRs(1一5)受体及其mRNA的表 达情况。并用生长抑素类似物一奥曲肤进行干预,流式细胞技术(F CM)检 测用药前后细胞周期和调亡的变化。RT-PCR和免疫组化方法检测部分洞亡 相关基因和蛋白的改变,对有关洞亡途径进行初步的探讨。 1.研究方法 细胞培养:人鼻咽癌细胞株CNE:由浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供, 在含10%小牛血清及青、链霉素各10OU的培养液RPMll640中,于 37oC、5%CO:条件下培养,细胞贴壁生长良好,每2一3天传代一次。 浙江大学硕士学位论文 1.2 RT-PCR反应及mRNA测序 1.2.1提取总RNA,提取的总RNA经紫外分光光度计测定提取物的浓度, OD260/2 80比值在1 .7一2.2之间。 1.2.2逆转录反应:用上述细胞中提取的3林g总RNA在下述20川反应体系中 逆转录cDNA。 1.2.3 RI’- PCR反应和琼脂糖凝胶电泳:取上述逆转录反应产物于25川反应体 积中进行pCR反应。制胶,分别别取12协1 pUC Mix Marker,8和20林1 PeR 反应产物点样。将凝胶通电电泳:looV,20一30分钟,紫外灯下观察有 无所需扩增的片段。 1.2.4 Rr-PCR扩增引物及PCR产物测序:生长抑素受体引物由上海博亚生物 公司设计并合成;PCR产物测序亦由该公司协助完成。 1.3流式细胞仪细胞周期分析和检测凋亡: 取对数生长期人鼻咽癌细胞株CNE一2细胞约5 x 1 05/m1接种于6孔板, 培养24h后,改用无血清培养24h,加入含40林g/ml oCT或不含oCT 的无血清培养基培养24h。胰酶消化细胞,送流式细胞仪检测,用多参 数细胞分析软件处理测定结果,对各样本进行DNA含量及细胞周期分 析,用ANNEX困v-FITc Kit凋亡试剂盒检测细胞凋亡,计算凋亡率。 1.4免疫细胞化学染色 选择指数生长期的CNE一2细胞,0.25%胰蛋白酶消化,制备单细胞悬液, 接种于内置玻片的培养皿,至70%细胞发生融合时分组:对照组(不 加药)、奥曲肤组(终浓度为1 X40林留ml)于24小时终止培养,取出 浙江大学硕士学位论文 玻片,按说明进行免疫细胞化学染色。 .5统计方法:用SPSS10.O统计包中单因素方差检验、双因素方差检验和 配对t检验。 2.结果 2 .2 2 .3 鼻咽癌细胞株(CNE一2)中生长抑素受体亚型检测结果(SSTRI一5的 mRNA的表达情况及免疫组化结果):逆转录一多聚酶链式反应 (RI’- PCR)检测到1、2和4受体mRNA的表达,其中SSTRI和SSTRZ 的PCR产物经测序和在NCBI的基因文库比对,完全符合人属SSTRI 和SSTRZ的mRNA序列。免疫组化染色镜下可见细胞膜SSTRI、 SSTRZ、SSTRZa和SSTR4受体染色为阳性。 奥曲肤干预后,细胞周期主要被阻滞在S期,细胞的调亡率增加,且均 有统计学差异。CNE一2细胞系cychnDI蛋白的表达为阳性,在奥曲肤 干预后则变为阴性。CNE一2细胞系CasPase一3的免疫组化染色结果在药 物干预前为阴性,而在药物干预后则为阳性。p53在药物干预前和干预 后为均为阴性。 鼻咽癌细胞系CNE一2中有抑制基因Survivin目的条带的表达,而在药 物干预后消失。 3.结论 3.1鼻咽癌细胞系CNE一2存在1、2和4受体n1RNA的表达,其中SSTRI 和SSTRZ的PCR产物经测序和在NCBI的基因文库比对,完全符合人 浙江大学硕士学位论文 属SSTRI和SSTRZ的m


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