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大鼠全脑缺血及NMDA脑损伤中ONO-1078保护作用及相关分子变化特点

张丽慧  
【摘要】: 脑缺血是致死致残率很高的常见疾病,因此,深入研究脑缺血损伤及抗损伤机制,寻找安全有效的治疗措施,已成为当前神经药理学研究的重要任务之一。兴奋性氨基酸受体N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体在脑缺血损伤的病理过程中起重要作用。脑缺血引起NMDA受体的异常表达和激活,钙离子大量内流,后者进一步触发神经元损伤和迟发性神经元死亡。另一方面,炎症细胞黏附分子,如血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)也参与脑缺血损伤过程。脑缺血后,细胞黏附分子表达上调,诱导随后的脑组织炎症反应和神经损伤。半胱氨酰白三烯(LTC_4,D_4,and E_4)受体拮抗剂ONO-1078{pranlukast,4-oxo-8-[p-(4-phenylbutyloxy)benzoyl-amono]-2-(tetrazd-5-yl)-4H-1-benzopyran hemihydrate}具有强大的抗炎和抗哮喘作用,用于哮喘的临床治疗。已有越来越多的证据表明,脑缺血损伤与半胱氨酰白三烯有关。在沙土鼠全脑缺血和大鼠局灶性脑缺血模型中,半胱氨酰白三烯产物增加,5-脂氧酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂能抑制缺血引起的半胱氨酰白三烯产物增加和神经损伤。这些发现提示ONO-1078在脑缺血中有潜在的治疗作用。 脑缺血动物模型主要有局灶性和全脑缺血两大类。在脑缺血研究中,本实验室已建立了大鼠和小鼠的局灶性脑缺血模型,并发现白三烯受体拮抗剂ONO-1078对大鼠和小鼠的 浙江大学博士学位论文 局灶性脑缺血具有保护作用。为了针对心脏意外、颅脑损伤、休克、缺氧等病理情况下的 全脑缺血损伤机制及其防治药物的研究,本实验首先建立了大鼠四血管结扎(4VO)全脑 缺血模型;观察了全脑缺血后脑组织损伤与兴奋性氨基酸NMDA受体和豁附分子VCAM.1 表达的变化特征及药物的干预作用;发现白三烯受体拮抗剂ONO一1078对大鼠全脑缺血具 有保护作用。最后,我们应用NMDA脑损伤模型对 0N0一1 078的神经保护作用机制进行了 进一步的分析和探讨。实验采用临床使用的新型脑缺血神经保护剂依达拉奉(edaravon。, Mcl-186,3一methyl一1一henyl一2一yrozo如一5一one)作为阳性对照药。 我们希望通过本研究能够阐明白三烯受体拮抗剂ONO一1 078对全脑缺血的神经保护作 用及其药理学特点;并且能够为今后更深入研究全脑缺血损伤的分子调节机制,寻找安全 有效的治疗药物打下基础。 一大鼠全脑缺血后脑组织损伤及NMDA受体和VCAM·1表达改变 Ll大鼠4VO全脑缺血再灌注模型 实验分两天进行。 第一天:a.椎动脉电凝:大鼠以10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,固定在立 体定位仪的耳杆上,将头向下30?,使椎板处于水平位置。枕骨后第1、2颈椎位置皮肤切 口,暴露第1颈椎及横突翼上的横突孔,以高频电凝针电凝两侧横突孔内的椎动脉,缝合 切口。b.颈动脉套扣放置:颈部正中切口,分离两侧颈总动脉并置套扣,但不结扎颈动脉。 缝合切口后将大鼠置笼内饲养,夜间禁食。 第二天:颈总动脉结扎。椎动脉电凝后24h,于大鼠清醒时结扎两侧颈总动脉。全脑 缺血的标准是:大鼠在30~605内昏迷、翻正反射消失、双狈吐瞳孔放大、痛反射消失,但 角膜反射存在,能自主呼吸。脑缺血3、5和10而n后恢复血流。实验过程中保持大鼠体温 在(37土0.5℃);缺血后翻正反射未消失及缺血后惊厥的大鼠均剔除。 缺血后1一14d,观察脑组织神经元损伤的组织学改变。我们发现,短暂性全脑缺血后 3一14d,海马CAI区和皮层神经元产生迟发性死亡。最适当的时间是缺血10n五n再灌注3- 浙江大学博士学位论义— 7d,室温22一25℃。 LZ大鼠短暂性全脑缺血后脑组织NMDA受体及VCAM·1衰达的改变 在4vo模型基础上,我们应用Westem blot方法检测了全脑缺血再灌注后不同时间脑 组织NMDA受体亚单位蛋白(NRI、NRZA、NAZB)及勃附分子VCAM一1的表达改变。 结果发现全脑缺血再灌注后,皮层NMDA受体NRI和NRZA亚单位表达分别于再灌注后1 和3d显著增加,NRZB亚单位在1一3d也显示较高水平;海马NRI亚单位表达在ld明 显下降,以后呈进行性升高,于14d达高峰;NRZA和NRZB表达有相似的趋向并于7d 明显增加。海马和皮层VCAM一1分别于再灌注后3和7d表达明显上调。这些结果提示了 短暂性脑缺血后皮层和海马的NMDA受体NRI、NRZA和NRZB亚单位蛋白及翻附分子 VCAM一1在不同时间表达增加;干预两者的表达可能减轻脑缺血再灌注损伤。 二.白三烯受体拮抗剂0N0一1 078对大鼠短暂性全脑缺血的神经保 护作用 以大鼠全脑缺血10而n再灌注72h造成全脑缺血再灌注模型。白三烯受体拮抗剂 oNo一1075(0.03,o一,0.3毗zkg),依达拉奉(10毗zkg),在脑缺血前30而n和再灌注 后lh各腹腔注射1次,以后每天1次。于缺血前和缺血后24、48和72h测定神经功能。 再灌注后72h测定大脑皮层和海马神经元密度及NMDA受体亚单位蛋白和VCAM一1的表 达改变。我们发现,。No一1078 0.1,0.3mg/kg显著地改善神经功能障碍,减少皮层和海马 神经元死亡。这些作用与临床使用的脑缺血神经保护剂依达拉奉相似。结果清楚地证明, ONo一1078对大鼠全脑缺血具有保护作用,类似于它对大鼠和小鼠局灶性缺血的保护作用。 硒几stem blot试


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