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新型丝氨酸蛋白酶SNC19生物学特性及肿瘤转移功能的研究

史影  
【摘要】: 肿瘤的发生发展是一个多因子参与多阶段的复杂过程。随着肿瘤分子生物学的飞速发展,越来越多的分子事件被大家所认识。探明各种相关因素,寻找新的肿瘤诊断与治疗的靶基因、靶蛋白,不仅对揭示肿瘤的发病机制具有重要意义,也为肿瘤的早期诊断及治疗甚至预防提供了依据。 为在分子水平寻找与人大肠癌发生发展相关的新因素,浙江大学肿瘤研究所应用减式杂交技术在正常人肠粘膜组织cDNA文库中,筛选到在正常人肠粘膜组织和肠癌组织中差异表达的新基因SNC19。并对该基因的序列结构、染色体定位、mRNA的表达及功能作了一系列的研究。研究表明:SNC19的基因组DNA全长为50420bp,包括19个外显子:cDNA全长为3142bp,共编码855个氨基酸,预计分子量为95KD。基因被定位于11号染色体q24-25区。其mRNA的表达主要分布在上皮来源的组织和细胞中。原位杂交显示大肠癌淋巴结转移组癌旁粘膜SNC19 mRNA表达阳性率(64.7%)高于无淋巴结转移组(15.4),有显著性差异(P<0.05)。对SNC19编码蛋白的功能区进行预测显示它是一个Ⅱ型跨膜蛋白,其N端在膜内,C端在膜外,由较短的胞内区,跨膜区和较长的胞外区组成,在胞外区的羧基端具有丝氨酸蛋白酶活性区域。该预测提示作为一种跨膜丝氨酸蛋白酶,它可能参与细胞表面的蛋白水解,介导一系列细胞功能乃至肿瘤的侵润转移等行为。 飞 浙汀大学俘士研充生伦文 与此同时,肠keuchi等在人前列腺癌细胞系PC一3中克隆得到一新的丝氨 酸蛋白酶基因MT-SPI,所报道序列与sNC19完全一致,并获得了其丝氨酸蛋白 酶的水解底物PARZ和sc一uPA[6,7〕。Lin.CY等在人乳腺癌细胞系T-47D及乳汁 中分离得到了一种新的丝氨酸蛋白酶MatriPtase,其cDNA序列为SNclg的一部 分,所缺为N端的一段序列,并在体外证明可水解pro一uPA和pro一HGF/sF形成 活性upA和HGF/sF侈91。而EPithin和XMT-sPI分别是小鼠和非洲爪蟾中获得 的与sNC19同源性极高的基因[l0.川。uPA和HGF/sF均被认为与ECM的降解 及肿瘤细胞的侵润非常相关,因此我们推测sNC 19舰T-spl/m aptriptase可能是一 转移相关基因,它和其它蛋白因子一起构成一个复杂的调控网络共同影响肿瘤的 侵润和转移。目前尚需更多的证据来证实上述观点。 为进一步研究SNC19与肿瘤转移的关系,了解该蛋白质的表达水平、翻译 后加工、定位及蛋白质之间的相互作用、内外部环境条件对它的影响,即蛋白质 本身的特性及功能研究显得非常必要。为此,我所制备了针对SNC19膜外区(氨 基酸565一855)的单克隆抗体,并经筛选,克隆化培养和特异性检测,最后挑选 出单克隆抗体株ZMGg。在此基础之上,本论文作了如下研究: 1 .SNclg编码蛋白在肿瘤细胞系和组织中的表达及分布 用所选SNC19单克隆抗体株ZMGg对乳腺癌细胞系BCAP37、大肠癌细 胞系C0LO205、SW480、SW620中SNC19蛋白的表达状况进行检测,发现 在前三种细胞系中主要特异性条带出现在120KD处,而SW620中未检测到 该条带。在所选的三个大肠癌肿瘤组织中出现了120KD、95KD和75KD三 种条带。用该单抗对细胞及组织标本做免疫组化,所选C0LO205细胞和食 道鳞癌组织标本的鳞癌细胞中、大肠癌组织癌细胞、子宫内膜癌组织癌细胞 浙江大学俘士研究史伦文 中SNC 19蛋白表达均为阳性,并可见细胞膜阳性现象。 2 .SNC19编码蛋白在真核细胞中加工及明胶酶活性研究 因在第一部分的实验中发现所选肿瘤细胞系用ZMGg单抗检测到 SNC19蛋白的主要形式为1 20kDa,比预计分子量95kDa大。而所选肿瘤组 织中SNC19蛋白的形式有多种。因此推测SNC19蛋白存在翻译后加工。为 证明该观点并检测真核表达sNC19蛋白的功能,本实验构建了 PseetagZA一sNC19(ORF)真核表达质粒,并转染至真核细胞BCAP37中表 达,产物经NiZ气nitrilotriaeetat。柱亲和纯化,用anti一His单抗检测得到120KD 和75KD两种形式,证明了翻译后加工的存在。明胶酶活性检测发现75KD 的具有较强的明胶酶活性,120KD和原核表达的全长SNC19(ORF)一GST 融合蛋白均未检测到该活性。 3.SNC19蛋白对细胞生物学行为的影响 为观察SNC19蛋白与细胞生长、增殖、迁移、粘附等与肿瘤生长及转移 密切相关的细胞生物学行为的关系,利用单抗阻断法设计了一系列细胞生物 学实验。和对照组相比,SNC19蛋白被阻断后,细胞生长周期、平板克隆形 成率均无明显差异,细胞迁移能力下降,短时间内细胞的同质、异质粘附能 力增强,随后粘附能力的差异逐渐减小。 4.SNC19结合蛋白的研究 利用免疫共沉淀法用SNC19单克隆抗体ZMGg从BCAP37细胞中钓到一结 合蛋白,经胶内酶解及Q一TOF串联质谱测序得到一段含16个氨基酸残基的序 列,经生物信息学查询确定为aetin(F一aetin)。用NetPhos软件对SNC19 蛋白膜内区的磷酸化位点进行分析显示在SNC19蛋白膜内区24位氨基酸残基 上有一个丝氨酸残基磷酸化位点,它的匹配率达到0.971。用anti一SNC19 mAb 浙汀大学俘士研究浇伦文 封闭SW480细胞,24小时后用罗丹明一鬼笔环肤染


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