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志贺菌流行株Ⅰ类和Ⅱ类整合子的特征及与耐药性关系的研究

潘劲草  
【摘要】: 近来的研究显示,革兰阴性菌中一种基因捕获和表达的遗传单位——整合子(integron)在细菌获得抗生素抗性机制中起了重要作用。整合子由整合酶(integrase)基因(intl)、整合酶特异性重组点attI和数目不定的基因盒(gene cassette)组成。基因盒往往由一个编码抗生素抗性的开放读码框(ORF)和一个整合位点attC组成。基因盒可从整合子中切除成为游离的环状分子,或者将外源基因盒捕获并整合入整合子。 近些年临床上分离的志贺菌对以往临床常用的抗生素逐渐耐药,有的菌株甚至多重耐药。以往研究表明,结合性质粒在志贺菌耐药性形成起了重要作用。新近数起研究报道了志贺菌中Ⅰ类和Ⅱ类整合子与菌株耐菌性关系。本研究对杭州地区近年分离的福氏和宋内氏志贺菌株进行Ⅰ类和Ⅱ类整合子的检测,了解其分布特征;进一步通过克隆测序和Southenblot,确定其携带的基因盒组成特征以及其在基因组中的位置;在研究中发现了一种缺少3’保守区的非典型Ⅰ类整合子,通过反转PCR了解此整合子的切除基因盒的特征;并对非典型Ⅰ类整合子和Ⅱ类整合子各自携带的aadA赋予宿主菌链霉素抗性的不同能力,进行了探讨。 本研究的64株宋内和福氏志贺菌中,63株分别于1998至2002年分离自杭州地区散发腹泻病人、暴发病人,1株分离自一起暴发事件的水源。 1.典型Ⅰ类整合子的分布及一级结构特征 典型的Ⅰ类整合子包括有5’保守片段(intI1)、可变基因盒区(引物inF~inB)和3’保守片段(引物qacEΔ1~sul1)。本文64株福氏和宋内志贺菌株中,三者均阳性 浙江大学博士学位论文 的菌株仅有6株,阳性率为9.4%。对其可变区测序分析,其中2株宋内志贺菌I 类整合子均携带1个基因盒,为氨基糖昔腺营酞基转移酶(aminoglycoside adenylyltransferase)AZ基因(aa朔2),编码对链霉素的抗性。另2株宋内志贺菌I类 整合子携带2个基因盒,分别紧邻5’保守区依次为二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase) Al型基因(咖月I)和氨基糖昔腺普酞基转移酶Ala基因是(a adAla),以及 二氢叶酸还原酶A17型基因(动讨I乃和氨基糖昔腺昔酞基转移酶Ala基因(aa咖习。 1株福氏志贺菌y变种携带的基因盒类型与其中一株宋内志贺菌相同,为护汉17和 aad减万。1株福氏6型志贺菌携带一个dfrV基因盒。分别提取2株携带典型I类整 合子的宋内志贺菌株基因组DNA和质粒DNA(其中基因组DNA经B“mHI和Pst I限制酶切),琼脂糖凝胶电泳后,intll探针Southenblot结果显示典型整合子是位 于质粒上的。 2.非典型I类整合子的分布及一级结构特征 在检测典型I类整合子过程中,发现了30株intll阳性,但可变区阴性、3’ 保守区阳性仅有3株(阳性率为5.1%),推测福氏志贺菌株中可能广泛存在着某种 非典型I类整合子。选择此类菌株分别提取基因组DNA和质粒DNA(其中基因组 DNA经BamHI和Pstl限制酶切),琼脂糖凝胶电泳后,intll探针SOuthenblot结 果显示提示此intll是位于细菌染色体上的。将其中CIOI一1株基因组DNA中intll 阳性的BamHI和Pstl限制酶切段(3 .4 kb)克隆至载体pUC19上(此质粒称为 puc一C101),并进行核酸序列测定。序列分析表明此插入片段依次由intll基因、 attl位点以及blaoxA_30和aadAI基因盒组成,典型I类整合子3’保守区部分被一 段插入序列151所替代。2个ORF分别编码p内酞胺酶OXA一30和氨基糖普腺昔 酞基转移酶Al。 应用扩增此型基因盒区的引物intl Ica一F和引物15 Ica一R,对本文所有菌株进行 PCR扩增,结果30株intll阳性的无典型I类整合子的志贺菌株中(1株宋内志贺 菌,29株福氏志贺菌),29株扩增出相同长度的PCR产物,而6株携带典型I类 整合子的志贺菌和其余28株intll阴性的志贺菌均未扩增出阳性条带(见表l)。结 果表明,此29株intll阳性志贺菌株有着相同的基因盒区,我们将之称为志贺菌非 典型I类整合子(intll和intH一151同时阳性);福氏志贺菌中此非典型I类整合子总 浙江大学博士学位论文 检出率高达84.8%(28/33),尤其是福氏2a和2b中均为100%(13/13和9/9):宋内 志贺菌中则较低,为3.2%(l/31)。非典型I类整合子阳性菌株中氨节青霉素抗性的 阳性率分别为100%(21/2l),而其他非典型I类播合子阴性菌株中为51.9%(14/27)。 3.非典型I类整合子的基因盒切除模式 我们使用反转PcR在携有pUC一c101的大肠埃希菌过夜培养肉汤煮沸物中检 测到了游离基因盒的存在,并发现了aadAI基因盒与blaoxA-30基因盒连锁的切除 模式。结果表明,此非典型I类整合子是功能性的。 4.H类整合子分布及其一级结构特征 通过检测n类整合子intIZ基因,结果发现H类整合子在宋内和福氏志贺菌中 分布广泛,阳性率分别达80.6%(25/31)和87.9%(29/33)。进一步研究表明11类整合 子是位于染色体上的。 提取intIZ阳性的宋内志贺菌C202株的基因组DNA,将一条含intIZ的去斤”d m限制酶切段(10.7 kb)克隆至载体pUC19上(此


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