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LOX-1介导Ox-LDL致动脉粥样硬化机制研究及阿托伐他汀对其过程的抑制作用

薛莉  
【摘要】: 背景 由动脉粥样硬化引起的心血管疾病是危害人类健康的常见病,研究动脉粥样硬化的发病机理及其防治对策是当今医学领域的重要课题之一。Ross认为动脉粥样硬化是一种有各种损伤因素引起的慢性增生性炎症。氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)是重要的致损伤因素,它通过其受体介导血管壁的损伤。LOX-1是1997年发现的凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体,属于C型凝集素家族的Ⅱ型膜蛋白,有学者认为Ox-LDL可以诱导LOX-1的mRNA表达,但一种受体是否有功能取决于它是否能在蛋白水平表达,而Ox-LDL是否可以诱导LOX-1在蛋白水平表达及组织细胞定位在国内还未见报道,LOX-1是否参与Ox-LDL引起的损伤也是需要明确的问题。内皮细胞是一个十分活跃的代谢及内分泌器官,其功能众多,本课题以内皮细胞为对象探讨这一问题。 一系列大型一、二级冠心病预防研究结果均显示他汀类药物对血脂紊乱及冠状动脉事件危险性的理想防治效果,降脂益处已无可争辩,他汀类药物抗炎、稳定斑块、抑制血管平滑肌细胞增殖等非降脂作用也日益受到重视,本实验研究阿托伐他汀对Ox-LDL诱导的内皮细胞表达LOX-1及其它生物学效应如ICAM-1、MCP-1 mRNA表达、NO分泌等的影响,以探讨阿托伐他汀的非降脂作用和潜存的治疗价值。 第一部分 Ox-LDL诱导LOX-1基因和蛋白表达及在细胞中的定位 方法:采用一步梯度法分离LDL,铜离子法制备Ox-LDL,将不同浓度Ox-LDL(20,40,60,80mg/L)与内皮细胞共孵育24h及浓度40mg/L的Ox-LDL作用内皮细胞不同时间(0、3、6、12、24h),半定量RT-PCR检测LOX-1在转录水平表达,细胞酶联免疫法测定LOX-1在蛋白水平表达,免疫组化观察LOX-1蛋白在内皮细胞 浙江人学博卜学位论文 的定位,免疫印迹法检测p38 MApK表达。 结果:1.加入Ox一LDL 20m留L使Lox一1 mRNA和蛋白表达量增加(尸0.01),40 m留L使其表达量达最高峰,随后逐渐下降。而同一浓度下从oh~24h的趋势是 LOX一1 mRNA和蛋l’l逐渐增加(尸0.01)。2.免疫组化显示:阴性对照组细胞无棕 色显示,培养基组(对照组)和Ox~LDL组细胞均见棕色着色的细胞,着色颗粒位 于细胞膜和细胞浆,Ox一1」DL组细胞的突起处都有棕色着色颗粒;Ox.LDL组累计 积分与对照组比较,差异显著(n二10)。3.磷酸化p38 MApK在Ox一LDL组明显高 于对照组和POLY组(尸0.01),而非磷酸化p38 MApK在三组间无差别。 第二部分LOX一1介导Ox-LDL对内皮细胞的损伤 方法:设下组:对照组;ox一LDL组:包括各种剂量的ox一LDL(20一80m留L)培 养细胞24h及ox一LDL 40 mg/L培养细胞不同时间(o·3、6、12、24h);polyinosinic aeid组(poLY组):先用LoX一1抑制剂polyinosinie aeid 25om留L作用细胞lh,然 后加ox一LDL 40m留L作用细胞24h。用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况, 硝酸还原酶法测定培养卜清液中NO浓度,半定量RT-PCR检测ICAM一1、MCP一1 mRNA表达。 结果:1.对照组细胞生长良好,轮廓不清,而Ox.LDL组细胞粗糙,轮廓增强,细 胞内有一许多发亮的颗粒,尤以80m留L组明显,POLY组细胞生长良好。2.ox一LDL 组土清液中NO的含量随Ox-LDL浓度增加而减少,较对照组分别减少了(17.14士 2.20)%、(35.98士5.79)%、(38.65士2.74)%、(48.34士3.40)%(p0.01)。在同一浓 度4om留L卜Ox一LDL加入内皮细胞培养不同时间(0、3、6、12、24)h,NO分 泌量随培养时间的延长而增加,分别是oh的(1 .55士0.39)倍、(2.02士0.57)倍、 (2.97士0.54)倍、(3.79士0.50)倍(P0.05)。3.ICAM一1 mRNA表达先随Ox~LDL 浓度增加而增加,Ox一LDL 60m留L时表达量达最大,是对照组的(2 .64士0.31)倍, 随后表达量随ox-LDL浓度增加而卜降。在同一浓度(4om留L)卜,ICAM一1 mRNA 的表达量先增加,6h达高峰,随后下降,24h和12h的表达量接近。4.MCp一lmRNA 表达随ox一LDL浓度(20一80m岁助递增。在ox一LDL同一浓度下先递增,12h MCP一lmRNA的表达量达最大,是oh的(2.96士0.28),然后又减少,24h是Oh 的(2.52士0.41)倍。5.polyinosinie aeid组细胞卜清液中的No浓度比对照组减少 (8.10士7.36)%(p0.05),而比4omg/Lox一LDL组增加( 1.44士0.14)倍(p0.01); 浙江大学博卜学位论文 四lyinosinic acid组的ICAM一lmRNA和MCp一lmRNA表达均较4omg/L ox一功L组 减少,分别减少了(27.24士3.64)%(P0.01)、(43.35士5.61)%(P0.01)。 第三部分阿托伐他汀对LOX一1介导的生物学过程的抑制作用 方法:设三组:对照组;ox一LDL组:ox一LDL 4Om留L培养细胞24h;阿托伐他汀 组:先用阿托法他汀10卜M、1卜M分别作用细胞lh,然后加Ox一LDL 40m留L作用 细胞24h。硝酸还原酶法测定细胞培养__巨清液中NO浓度,半定量RT-PCR检测 LOx一1、ICAM一1、MCP一1 mRNA表达,细胞酶联免疫法测定Lox一1在蛋白水平表 达,免疫印迹法检测p38 MApK表达。 结果:L加入Ox~LDL使上清液中NO的含量减少(36.00士5.80)%(尸0.01),阿 托伐他汀1林M·10协M组较对照组分别减少(23.70土6.40)%(p0.05)、(x3.钓士 5.70)%(p0.05),而较ox一LDL组增加(1.19+0.2


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